산모 - 태아 인터페이스에서 쥐의 조직에서 백혈구의 분리
Summary
Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.
Abstract
임신에서 면역 관용은 어머니의 면역 체계가 현상 태아에 동의하고 육성하기 위해 특유의 변화를 겪는 것을 요구한다. 이 허용 오차는 성교시에 시작 Fecundation는과 주입 중 설립, 임신 동안 유지된다. 산모 – 태아 관용의 활성 세포 및 분자 매개은 태반과 자궁과 탈락 막 조직을 포함하는 산모 – 태아 인터페이스로 알려진 태아와 산모의 조직 사이의 접촉의 사이트에 충실. 이 인터페이스는, 기질 세포 및 백혈구 침윤으로 구성되고, 그 표현형 풍부하고 임신에 걸쳐 변화. 모체 – 태아의 계면에 침투 백혈구 함께 임신 지탱 로컬 미세 환경을 만들 호중구, 대 식세포, 수지상 세포, 비만 세포, T 세포, B 세포, NK 세포, 및 NKT 세포를 포함한다. 이 세포 또는 inapprop 간의 불균형자신의 표현형에 riate 변경은 임신 질병의 메커니즘을 고려된다. 따라서, 산모 – 태아 인터페이스를 침투 백혈구의 연구는 임신 관련 합병증으로 이어질 면역 메커니즘을 규명하기 위해 필수적이다. 본원에 기재된 단백질 분해 및 모체 – 태아의 계면에서 뮤린 조직으로부터 침윤 백혈구를 분리 collagenolytic 효소 칵테일 강력한 효소 세분화이어서 부드러운 기계적 해리의 조합을 사용하는 프로토콜이다. 이 프로토콜은 충분히 보존 항원 및 기능적 특성을 가진 가능한 백혈구 (> 70 %)의 높은 숫자의 분리 수 있습니다. 격리 백혈구이어서 면역 표현형, 세포 분류, 영상화, 면역, mRNA 발현, 세포 배양, 및 혼합 백혈구 반응, 증식 또는 세포 독성 분석 시험 관내 기능 분석 등을 포함한 몇 가지 기술에 의해 분석 될 수있다.
Introduction
특징적인 변화가 어머니의 면역 시스템 내에서 발생하는 경우 임신 면역 관용은 기간입니다. 이러한 변화는 어머니가 태아, 반 동종 이식 (1)을 허용 할 수 있습니다. 태아는 아버지의 주요 조직 적합성 복합체 (MHC)는 항원이, 태아 세포가 모체 순환 3에서 발견 된 표현; 그러나 태아는 4,5를 거부하지 않습니다. 이 수수께끼는 완전히 이해되지 않습니다.
가장 최근의 가설은 산모 – 태아의 허용 오차가 성교 중에 생성 및 6,7 Fecundation는과 만삭 임신 8 ~ 10을 유지하기 위해 유지되는 것을 말한다. 이 산모 – 태아 관용의 고장은 임신 10-16의 초기와 후기 단계에서 질병의 메커니즘을 고려된다. 모체 – 태아의 공차는 T 세포 (T 조절 세포, Th1 세포, TH2 세포와 Th17 세포), MAC 등 다양한 백혈구 하위 집단의 참여를 수반rophages, 호중구, 비만 세포, NK 세포, 및 NKT 세포, 수지상 세포 및 B 세포, 임신 15,17-19 걸쳐 밀도 및 위치 파악에 그 변화. 어머니의 면역 체계가 태아 항원 (20, 21)와 상호 작용하는 해부학 사이트 – 산모 – 태아의 허용 오차는 산모 – 태아 인터페이스 (20)에서 농축된다.
태아 extravillous 영양막 세포가 자궁 점막 22-24를 침공 할 때 산모 – 태아 인터페이스는 태반 중에 작성됩니다. 이 인터페이스의 태아 측면에서, 태아를 둘러싸고있는 막은 태반 내에서 전문 상피 표면을 생성하고, 융합 세포의 세포는 산모의 혈액 (22)과의 직접 접촉을 통해 영양 교환을 제어 할 수 있습니다. 인터페이스의 모체 측에서 탈락은 모든 마우스에서 탈락 막 세포의 50 %로 30 %를 차지하고 백혈구 이종 풀을 모집. matern에 참여하는 것 외에도알 면역 관용,이 세포는 임신 기간 동안 다른 프로세스, 예., 감염, Fecundation는에서 생식 기관의 보호, 배아 이식 7,25, 탈락 혈관 신생 (26), 혈관 재 24,27, 영양막 세포 침윤 (28), 태반의 핵심 기여자입니다 개발 24, 25, 및, 궁극적으로, 노동 및 배달 15,17. 따라서, 산모 – 태아 내성에 관여하는 백혈구의 연구는 임신 관련 합병증의 발병 기전을 해명하는 것이 필수적입니다.
면역 조직 화학 염색 및 면역 형광의 사용이 직접 시각화 및 자궁, 탈락, 또는 태반 백혈구 (29, 30)의 국산화에 대한 데이터를 생성하고 있지만, 더 이러한 조직 (31, 32)의 각각에 백혈구의 특정 부분 집합을 밝혔다 분석 유동 세포 계측법. 또한 계측법 밀도 메이터의 비율을 결정하기 위해 사용되어왔다 흐름NAL-태아 인터페이스는 세포와 세포 내 단백질 8-10,34 33과 표현 수준을 백혈구. 모체 – 태아의 계면에서 백혈구 세포 계측 분석 흐름은 단일 세포 현탁액을 필요로한다. 탈락, 자궁, 태반 조직으로부터 침윤 백혈구를 분리하기 위해, 티슈 해리의 두 가지 방법이 사용되고있다 : 기계적 및 효소. 두 가지 방법이 조직의 세포 외 기질 (ECM)에서 침투 백혈구의 분리를 할 수 있습니다. 덜 전단력 – 관련 손상 (35) 백혈구의 높은 수율을 허용하는 조직 분해 효소는 조직 기계적 해리 우수하다. 따라서, 기계적 해리 티슈 샘플의 가변성 및 이질성 조직을 증가시킬 수있다 (36)를 필요로 풀링. 그러나, 기계적 해리 관심 항원 또는 효소 분해에 의해 변경 될 때 때 선택이 세포의 기능관심의 필요의 보존되는 (예., NK 세포의 세포 독성) 35.
ECM을 저하 특정 단백질 분해 효소의 사용은 기계적 해리 관찰 저수율을 제거한다. 여러 연구 트립신 (32), 콜라게나 제 (37)의 DNase (31), (38) 디스 파제, 각종 효소 32,39의 상업 칵테일의 사용 신고되었습니다. 그러나, 자연 및 다른 효소의 농도 및 분해 기간 꼼꼼하게 정의 면역 표현형에 필요한 세포 표면 항원 성 에피토프의 무결성의 유지를 보장하기 위해 검증되어야한다. 다양한 표면 구조는 다수의 단일 클론 항체에 의해 인식 백혈구 표면 에피토프 스트리핑 악명되고, 트립신과 같은 일부 효소와 다른 효소에 의해 파괴 차분 쉽다.
본원에 도입 proteolyt를 사용하는 방법이다Accutase라고 IC와 collagenolytic 효소 칵테일. 이 효소 용액을 충분히 모체 – 태아의 계면에서 해리 뮤린 조직 내 여전히 효율적으로 완만하고, 해리 반응을 정지 해리 다른 시약 또는 혈청의 첨가를 필요로하지 않는다. 해리 시간을 검증 할 필요가 있지만, 또한, 그것은 전술 한 효소 40,41보다 더 강력, 공급로 사용할 준비하고.
조직 세분화 두 유형의 조합의 이용은 얻어지는 전지의 품질과 양을 향상시킨다; 따라서, 여러 연구 결과는 만족할 31,32,37와 기계적 및 효소 적 분해의 병용을 시행하고있다. 여기에 설명 된 프로토콜은 설립 우리의 실험실에서 검증되었다 이것은 강력한 효소 세분화이어서 부드러운 기계적 해리의 조합을 사용한다. 이 프로토콜은의 고립과 더 많은 연구를 할 수 있습니다산모 – 태아 인터페이스에서 쥐의 조직에 침투 백혈구 (자궁, 탈락 및 태반). 유세포 분석에 의해 입증 된 바와 같이 다음과 같은 프로토콜은 세포 표면 마커 및 하류 어플리케이션에 충분한 수율을 생세포의 무결성을 유지한다. 마지막으로,이 프로토콜은 분석 모체 – 태아의 인터페이스를 구성하는 다른 뮤린 조직의 비교 세포 제제의 일관성을 유지한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
산모 – 태아 인터페이스에 침투 백혈구의 풍요 로움과 표현형 특성을 기록하고 일관된 데이터의 수집은 임신 관련 합병증의 발병 기전을 이해하는 데 필수적이다. 몇 가지 기술은 임신 31,38,39,43-46 걸쳐 모체 – 태아의 계면에서 뮤린 조직으로부터 백혈구 침투의 분리를 용이하게하는 기술되었다. 그러나, 각각의 기술은 다르고, 항상 분리 된 세포의 생존 능력을 지정하지 않고, 가장 중요한…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NGL은 모자, 주 산기 모자 건강에 웨인 주립 대학 주 산기 이니셔티브에 의해 지원되었다. 우리는 기꺼이 원고의 비판적인 읽기 모린 McGerty 에이미 E. Furcron (웨인 주립 대학)을 인정합니다.
Materials
| Magentic Cell Separation | |||
| MS Columns | |||
| Cell Separator | |||
| 30μm pre separation filters | |||
| Multistand | |||
| 15mL safe lock conical tubes | |||
| MACS Buffer | (0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS) | ||
| Reagents | |||
| Anti-mouse CD16/CD32 | |||
| Anti-mouse extracellular antibodies | (Table 1) | ||
| Sodium azide | |||
| Bovine serum albumin | (BSA) | ||
| LIVE/DEAD viability dye | |||
| Fixation buffer solution | |||
| FACS Buffer | (1% bovine serum albumin, 0.5% sodium azide, and 1X PBS ph 7.2) | ||
| Trypan Blue Solution 0.4% | |||
| Fetal bovine serum | |||
| Additional Instruments | |||
| Incubator with shaker | |||
| Flow cytometer | |||
| Centrifuge | |||
| Vacuum system | |||
| Incubator | |||
| Water bath | |||
| Cell counter | |||
| Microscope |
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