Isolatie van leukocyten uit de Murine Tissues de Maternal-Fetal Interface

Summary

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Abstract

Immuuntolerantie in de zwangerschap vereist dat het immuunsysteem van de moeder ondergaat opvallende veranderingen om te accepteren en te koesteren de zich ontwikkelende foetus. Deze tolerantie wordt gestart tijdens de coïtus, tijdens bevruchting en implantatie opgericht en onderhouden tijdens de zwangerschap. Actieve cellulaire en moleculaire mediatoren van tolerantie maternale-foetale worden verrijkt op de plaats van contact tussen foetale en maternale weefsels, zogenaamde maternale-foetale interface, die de placenta en de baarmoeder en deciduale weefsel omvat. Deze interface omvat stromale cellen en infiltrerende leukocyten en hun overvloed en fenotypische karakteristieken verandert in de loop van de zwangerschap. Infiltrerende leukocyten in het maternale-foetale-interface omvatten neutrofielen, macrofagen, dendritische cellen, mestcellen, T-cellen, B-cellen, NK-cellen en NKT cellen die tezamen de lokale micro-omgeving die de zwangerschap in stand te creëren. Een onbalans tussen deze cellen of inappropriate verandering in hun fenotypen wordt beschouwd als een mechanisme van ziekte tijdens de zwangerschap. Daarom is de studie van leukocyten dat de maternale-foetale-interface infiltreren is essentieel om de immune mechanismen die leiden tot zwangerschap verwante complicaties helderen. Hierin beschreven is een protocol dat een combinatie van zachte mechanische dissociatie gevolgd door een sterke enzymatische disaggregatie met een proteolytische en collagenolytische enzymatische cocktail de infiltrerende leukocyten uit de muizen weefsels te isoleren van de maternale-foetale interface gebruikt. Dit protocol maakt de isolatie van grote aantallen levensvatbare leukocyten (> 70%) met voldoende geconserveerde antigene en functionele eigenschappen. Geïsoleerde leukocyten kan vervolgens worden geanalyseerd door verscheidene technieken, waaronder immunofenotypering, celsortering, imaging, immunoblotting, mRNA expressie, celkweek en in vitro functionele testen zoals gemengde leukocyt reacties, proliferatie of cytotoxiciteit assays.

Introduction

Immunotolerantie bij zwangerschap is een periode waarin kenmerkende reactie plaatsvinden het immuunsysteem van de moeder. Deze veranderingen kan de moeder naar de foetus, een semi-allogeen transplantaat ¹ tolereren. De foetus tot expressie vaderlijke major histocompatibility complex (MHC) antigenen ² en foetale cellen gevonden in de moederlijke circulatie ^3; echter de foetus niet verworpen ^4,5. Dit raadsel is niet helemaal duidelijk.

De meest recente hypothese stelt dat de moeder-foetale tolerantie wordt gemaakt tijdens de coïtus en bevruchting ^6,7 en onderhouden om een voldragen zwangerschap ^8-10 ondersteunen. Een uitsplitsing van deze moeder-foetale tolerantie wordt beschouwd als een mechanisme van de ziekte tijdens de vroege en late stadia van de zwangerschap ^10-16. Maternale-foetale tolerantie betreft de deelname van diverse leukocyten subpopulaties, waaronder T-cellen (regulatoire T-cellen, Th1-cellen, Th2-cellen, en Th17 cellen), macrophages, neutrofielen, mastcellen, NK-cellen en NKT-cellen, dendritische cellen en B-cellen, die verandering in dichtheid en lokalisatie gedurende de zwangerschap ^15,17-19. Maternale-foetale tolerantie verrijkt ten maternale-foetale-interface ²⁰ – de anatomische plaats waar het immuunsysteem van de moeder interageert met de foetale antigenen ^20,21.

De moeder-foetale interface is gemaakt tijdens placentatie wanneer de foetale extravilleuze trofoblastcellen binnenvallen de baarmoeder slijmvlies ^22-24. Aan de foetale kant van deze interface, de vliezen rond de foetus het creëren van een gespecialiseerde epitheeloppervlak binnen de placenta en de syncytiotrofoblast cellen controle van de uitwisseling van voedingsstoffen via hun direct contact met bloed van de moeder ^22. Aan moederszijde van de interface, de decidua rekruteert heterogene pool van leukocyten in muizen die verantwoordelijk zijn voor 30% tot 50% van alle decidua cellen. Naast hun deelname aan Maternal immuun tolerantie, deze cellen zijn de belangrijkste bijdragers aan verschillende processen tijdens de zwangerschap, bijv., de bescherming van de voortplantingsorganen van infecties, bevruchting, embryo implantatie ^7,25, deciduale angiogenese ^26, vasculaire remodeling ^24,27, trofoblastinvasie ^28, placenta ontwikkeling ^24,25, en, uiteindelijk, arbeid en levering ^15,17. Daarom is het onderzoek van de bij maternale-foetale tolerantie leukocyten is essentieel voor het ophelderen van de pathogenese van zwangerschap gerelateerde complicaties.

Hoewel het gebruik van immunohistochemie en immunofluorescentie gegevens heeft gegenereerd voor de directe visualisatie en lokalisatie van baarmoeder, decidua of placenta leukocyten ^29,30 flowcytometrie analyse bleek voorts specifieke subsets van leukocyten in elk van deze weefsels ^31,32. Daarnaast flowcytometrie is gebruikt om de dichtheid en percentage mater vastnal-foetale-interface leukocyten ³³ en expressie van extracellulaire en intracellulaire eiwitten ^8-10,34. Flow cytometrische analyse van leukocyten bij de moeder-foetale-interface vereist een single-cell suspensie. Om infiltrerende leukocyten te isoleren van de deciduale, baarmoeder, placenta en weefsels zijn twee methoden weefsel dissociatie gebruikt: mechanische en enzymatische. Beide werkwijzen maken de scheiding van geïnfiltreerde leukocyten uit de extracellulaire matrix (ECM) van deze weefsels. Enzymatische weefsel dissociatie is superieur aan mechanische weefsel dissociatie omdat het zorgt voor een hogere opbrengst van leukocyten met minder shear-force-bijbehorende schade ^35. Bijgevolg mechanische weefsel dissociatie vraagt ​​erom weefsel ^36, waarbij de variabiliteit en heterogeniteit van de monsters kan toenemen. Toch kan mechanische dissociatie de keuze bij het antigeen van belang kan worden veranderd door enzymatische dissociatie of wanneer de functionaliteit van de cels plaats moeten worden behouden (bijv., cytotoxiciteit van NK-cellen) ^35.

De toepassing van proteolyse van specifieke enzymen om de ECM breken elimineert de lage opbrengsten waargenomen met mechanische dissociatie. Verschillende studies hebben melding gemaakt van het gebruik van trypsine ^32, collagenase ^37, DNase ^31, dispase ³⁸ en commerciële cocktails van verschillende enzymen ^32,39. Echter, de aard en concentratie van de verschillende enzymen en de duur van digestie nauwkeurig worden vastgesteld en gevalideerd om handhaving van de integriteit van het celoppervlak antigene epitopen vereist voor immunofenotypering waarborgen. De verschillende oppervlaktestructuren zijn differentieel gevoelig voor vernietiging door verschillende enzymen, met sommige enzymen, zoals trypsine, die bekend voor het strippen van leukocyten oppervlakte epitopen herkend door verschillende monoklonale antilichamen.

Hierin wordt geïntroduceerd is een methode waarbij een proteolytic en collagenolytische enzymatische cocktail, genaamd Accutase. Deze enzymatische oplossing is mild genoeg terwijl efficiënt dissociëren murine weefsels bij de maternale-foetale interface en vereist geen toevoeging van andere dissocieert reagentia of serum dat zij de dissociatie reactie te beëindigen. Bovendien is het klaar voor gebruik en behoeft, hoewel de tijd van dissociatie moet worden bevestigd, is robuuster dan de bovengenoemde enzymen ^40,41.

Het gebruik van een combinatie van beide soorten weefsel disaggregatie verbetert de kwaliteit en de hoeveelheid cellen verkregen; aldus, hebben verschillende studies het gecombineerde gebruik van mechanische en enzymatische dissociatie uitgevoerd met bevredigende resultaten ^31,32,37. De hierin beschreven protocol werd vastgesteld en gevalideerd in ons laboratorium; Het gebruikt een combinatie van een zachte mechanische dissociatie gevolgd door een sterke enzymatische uitsplitsing. Dit protocol maakt de isolatie en verdere studiede infiltrerende leukocyten in muizen weefsels bij de maternale-foetale interface (uterus, decidua en placenta). Het volgende protocol handhaaft de integriteit van celoppervlak markers en levert voldoende levensvatbare cellen voor verdere toepassingen zoals aangetoond door flow cytometrische analyse. Ten slotte is dit protocol handhaaft de samenhang van celpreparaat voor de analyse en vergelijking van verschillende murine weefsels van het maternale-foetale interface.

Protocol

Voor het werken met de in dit protocol genoemde monsters, moet dier ethische goedkeuring worden gegeven door de lokale Research Ethics Committee en de Institutional Review Boards. Bij het werken met dierlijk bloed, cellen, of gevaarlijke stoffen als bedoeld in dit protocol, moet de juiste bioveiligheid en laboratorium veiligheid acties worden opgevolgd. 1. Mouse Handling en Tissue Collection Bereid een steriele werkplek en het verkrijgen van steriele instrumenten voor het weefsel …

Representative Results

De dissectie van muizen weefsels van de maternale-foetale interface is weergegeven in figuur 1; Deze procedure omvat het openen van de peritoneale holte (Figuur 1A, B), baarmoederhoorns (figuur 1C) met de implantatieplaatsen (figuur 1D), en het verzamelen van de baarmoederweefsels (Figuur 1E), placenta (Figuur 1F), en decidua weefsels (figuur 1G) en 16,5 dpc. Figuur 2 toont de morfologi…

Discussion

Het verzamelen van consistente gegevens die de overvloed en fenotypische kenmerken van het infiltreren leukocyten registreert bij de moeder-foetale interface is van essentieel belang voor het begrijpen van de pathogenese van de zwangerschap gerelateerde complicaties. Verschillende technieken beschreven dat de isolatie van infiltrerende leukocyten uit de muizen weefsels bij maternale-foetale-interface gedurende de zwangerschap ^{31,38,39,43-46} vergemakkelijken. Echter, elke techniek verschilt, gebruikt verschill…

Materials

			Magentic Cell Separation
MS Columns
Cell Separator
30μm pre separation filters
Multistand
15mL safe lock conical tubes
MACS Buffer			(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)
			Reagents
Anti-mouse CD16/CD32
Anti-mouse extracellular antibodies			(Table 1)
Sodium azide
Bovine serum albumin			(BSA)
LIVE/DEAD viability dye
Fixation buffer solution
FACS Buffer			(1% bovine serum albumin, 0.5% sodium azide, and 1X PBS ph 7.2)
Trypan Blue Solution 0.4%
Fetal bovine serum
			Additional Instruments
Incubator with shaker
Flow cytometer
Centrifuge
Vacuum system
Incubator
Water bath
Cell counter
Microscope