Summary

בידוד של לויקוציטים מרקמות Murine בממשק האם והעובר

Published: May 21, 2015
doi:

Summary

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Abstract

סובלנות חיסונית בהריון דורשת שהמערכת החיסונית של האם עוברת שינויים ייחודיים במטרה לקבל ולטפח את העובר המתפתח. סובלנות זה הוא שיזמה במהלך משגל, הוקמה במהלך הפריה וההשתלה, ונשמרה לאורך הריון. מתווכים תאיים ומולקולריים פעילים של סובלנות אימהית-עוברית מועשרים באתר של קשר בין רקמות עובריות ואימהיות, הידוע בממשק האימהי-עוברי, הכולל את השליה ורחם ורקמות decidual. ממשק זה מורכב מתאי סטרומה ולויקוציטים הסתננות, ומאפייני השפע ופנוטיפי לשנות במהלך ההריון. לויקוציטים מסתנן בממשק האימהי-עוברי כולל נויטרופילים, מקרופאגים, תאים דנדריטים, תאי פיטום, תאי T, תאי B, תאי NK, ותאי NKT שיחד יוצרים מיקרו-הסביבה המקומית המקיימת הריון. חוסר איזון בין תאים אלה או כל inappropשינוי riate בפנוטיפים שלהם נחשב למנגנון של מחלה בהריון. לכן, המחקר של לויקוציטים שלהסתנן הממשק אימהי-העוברי הוא חיוני על מנת להבהיר את מנגנוני החיסון שיובילו לסיבוכים הקשורים להריון. תאר במסמך זה הוא פרוטוקול שמשתמש בשילוב של ניתוק מכאני העדין ואחריו disaggregation האנזימטית חזק עם מפרקי חלבונים וקוקטייל האנזימטית collagenolytic לבודד את כדוריות דם לבנות שחדרו מהרקמות עכברי בממשק אימהי-העוברי. פרוטוקול זה מאפשר הבידוד של מספרים גבוהים של כדוריות דם לבנות קיימא (> 70%) עם מאפייני אנטיגני ופונקציונליים מספיק שימור. אז יכולים להיות מנותח על ידי כדוריות דם לבנות מבודדים כמה טכניקות, כולל immunophenotyping, מיון תא, הדמיה, immunoblotting, ביטוי mRNA, תרבית תאים, ובמבחני מבחנה פונקציונליים כגון תגובות מעורבות לויקוציטים, הפצה, או מבחני רעילים.

Introduction

סובלנות חיסונית בהריון היא תקופה בה שינויים ייחודיים להתרחש בתוך המערכת החיסונית של האם. שינויים אלו מאפשרים לאם לעובר תסבול, שתל למחצה אלוגנאית 1. העובר מבטא מורכב histocompatibility גדול אבהי (MHC) אנטיגנים 2, ותאים עובריים כבר נמצאו במחזור הדם האימהי 3; עם זאת, העובר לא נדחה 4,5. חידה זה לא מובן לחלוטין.

ההשערה האחרונה קובע כי סובלנות אימהית-עוברית נוצר במהלך משגל והפרית 6,7 ומתוחזק כדי לקיים הריון טווח מלא 8-10. פירוט של סובלנות אימהית-עוברי זה נחשב מנגנון של מחלה במהלך הריון 10-16 המוקדם ומאוחר שלבים. סובלנות האם ועובר כרוך בהשתתפות תת-אוכלוסיות לויקוציטים שונות, כוללים תאי T (תאי T רגולטורים, תאי Th1, תאי Th2, ותאי TH17), מקrophages, נויטרופילים, תאי פיטום, תאי NK, ותאי NKT, תאים דנדריטים, ותאי B, ששינוי בצפיפות ולוקליזציה במהלך הריון 15,17-19. סובלנות האם ועובר מועשרת בממשק אימהי-העוברי 20 – האתר אנטומיים בי המערכת החיסונית של האם אינטראקציה עם אנטיגנים העובריים 20,21.

הממשק אימהי-העוברי נוצר במהלך placentation כאשר תאי trophoblast extravillous העובריים לפלוש רירית רחם 22-24. בצד העוברי של ממשק זה, הקרומים המקיפים את העובר ליצור משטח אפיתל מיוחד בתוך השליה, ותאי syncytiotrophoblast לשלוט בבורסה התזונתית באמצעות המגע הישיר שלהם עם דם אימהי 22. בצד האימהי של הממשק, decidua מגייס בריכת הטרוגנית של לויקוציטים שבעכברים כ -30% עד 50% מכל תאי decidual. בנוסף להשתתפותם בmaternסובלנות חיסונית אל, תאים אלה הם תורמים מרכזיים לתהליכים שונים במהלך הריון, למשל., שליה ההגנה על מערכת הרבייה מזיהומים, הפריה, השרשת עובר 7,25, אנגיוגנזה decidual 26, שיפוץ כלי דם 24,27, פלישת trophoblast 28, פיתוח 24,25, וסופו של דבר, עבודה ומסירה 15,17. לכן, המחקר של לויקוציטים המעורב בסובלנות אימהית-עוברית הוא חיוני להבהרת פתוגנזה של סיבוכים הקשורים להריון.

בעוד שהשימוש באימונוהיסטוכימיה וimmunofluorescence יצר נתונים להדמיה הישירה והלוקליזציה של רחם, decidual, או כדוריות דם לבנות שליה 29,30, cytometry זרימת הניתוח חשף נוסף תת ספציפי של לויקוציטים בכל אחד מרקמות אלה 31,32. בנוסף, cytometry זרימה נעשה שימוש כדי לקבוע את הצפיפות וחלקם של מאטרסופי-עוברי ממשק לויקוציטים 33 וביטוי רמות של חלבונים תאיים ו תאיים 8-10,34. ניתוח תזרים cytometric של לויקוציטים בממשק אימהי-העוברי דורש השעיה תא בודד. כדי לבודד לויקוציטים מסתנן מdecidual, הרחם, ורקמות שליה, שתי שיטות של ניתוק רקמה שימשו: מכאנית והאנזימטית. שני השיטות לאפשר את ההפרדה של לויקוציטים הסתנן מהמטריצה ​​תאית (ECM) של רקמות אלה. ניתוק רקמה אנזימתי עדיף על ניתוק רקמה מכאני שכן היא מאפשרת תשואה גבוהה יותר של כדוריות דם לבנות עם הנזק קשור-כוח גזירה פחות 35. כתוצאה מכך, ניתוק רקמה מכאני דורש איגום רקמות 36, אשר עשוי להגדיל את השונות וההטרוגניות של הדגימות. עם זאת, ניתוק מכאני עשוי להיות הבחירה כאשר אנטיגן של עניין ניתן לשנות על ידי ניתוק האנזימטית או כאשר פונקציונלי של התאים של צורך העניין לשימור (לדוגמא., רעיל של תאי NK) 35.

השימוש בproteolysis עם אנזימים ספציפיים לבזות ECM מבטל את התשואות נמוכות שנצפו עם ניתוק מכאני. מספר מחקרים דיווחו על השימוש בטריפסין 32, collagenase 37, 31 DNase, dispase 38, וקוקטיילים מסחריים של אנזימים שונים 32,39. עם זאת, הטבע והריכוז של אנזימים שונים ואת משך הזמן של עיכול חייב להיות מוגדר בקפדנות ומאומתים על מנת להבטיח שמירה על שלמותו של אפיטופים אנטיגני פני תא הנדרשים לimmunophenotyping. מבני המשטח שונים באופן דיפרנציאלי רגישים להרס על ידי אנזימים שונים, עם כמה אנזימים, כגון טריפסין, להיות ידוע לשמצה בהפשטת epitopes משטח יקוציט מוכרת על ידי רבים נוגדנים חד-שבטיים.

הציג במסמך זה הוא שיטה באמצעות proteolytIC וקוקטייל האנזימטית collagenolytic, נקרא Accutase. פתרון האנזימטית זה עדין מספיק ועדיין יעיל במתנער רקמות עכברי בממשק האימהי-עוברי, ואינו דורש תוספת של חומרים כימיים מתנערים אחרים או סרום לסיים את תגובת הניתוק. יתר על כן, הוא מוכן לשימוש כפי שסופק ו, למרות שהזמן של ניתוק צריך להיות מאומת, זה יותר חזק מאשר האנזימים הנ"ל 40,41.

הניצול של שילוב של שני הסוגים של רקמות disaggregation משפר את האיכות וכמות התאים שהושגו; כך, מספר מחקרים יישמו את השימוש בשילוב של ניתוק מכאני והאנזימטית עם תוצאות משביעות רצון 31,32,37. הפרוטוקול המתואר במסמך זה הוקם ומאומתים במעבדה שלנו; היא משתמשת בשילוב של ניתוק מכאני עדין ואחריו disaggregation האנזימטית חזק. פרוטוקול זה מאפשר מחקר והבידוד נוסף שללויקוציטים מסתנן ברקמות עכברית בממשק האימהי-עוברי (רחם, decidua, ושליה). הפרוטוקול הבא גם שומר על השלמות של סמנים פני תא ותשואות מספיק תאי קיימא עבור יישומים במורד הזרם כפי שהודגם על ידי ניתוח התזרים cytometric. לבסוף, פרוטוקול זה שומר על העקביות של תא הכנה לניתוח והשוואה של רקמות עכברי שונות המרכיבות את הממשק אימהי-עוברי.

Protocol

לפני העבודה עם הדגימות שהוזכרו בפרוטוקול זה, אישור אתי בבעלי החיים חייב להינתן על ידי הוועדה המקומית לחקר האתיקה ולוחות הסקירה המוסדית. כאשר עובדים עם דם של בעלי חיים, תאים, או סוכנים מסוכנים כאמור בפרוטוקול זה, פעולות הבטיחות הביולוגית ובטיחות במעבדה הנאותה חייבים ?…

Representative Results

הנתיחה של רקמות עכברי מהממשק האימהי-העוברי מוצגת באיור 1; הליך זה כולל פתיחת חלל הצפק (איור 1 א ', ב'), קרן הרחם (איור 1 ג) כוללים אתרי ההשתלה (1D איור), והאוסף של רקמות הרחם (איור 1E), שליה (איור 1F), ורקמות decidual (איו?…

Discussion

איסוף נתונים עקביים שמתעד את מאפייני השפע ופנוטיפי של לויקוציטים מסתנן בממשק אימהי-העוברי הוא חיוני להבנת הפתוגנזה של סיבוכים הקשורים להריון. כמה טכניקות תוארו המאפשרות הבידוד של חדירה לויקוציטים מהרקמות עכברי בממשק האימהי-עוברי במהלך הריון 31,38,39,43-46. עם זאת, ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NGL נתמכה על ידי Perinatal אוניברסיטת היוזמה ויין מדינה באימהי, Perinatal ובריאות ילד. אנו בתודה להכיר מורין McGerty ואיימי א Furcron (אוניברסיטת ויין סטייט) לקריאה הביקורתית שלהם של כתב היד.

Materials

Magentic Cell Separation
MS Columns
Cell Separator
30μm pre separation filters
Multistand
15mL safe lock conical tubes
MACS Buffer (0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)
Reagents
Anti-mouse CD16/CD32
Anti-mouse extracellular antibodies (Table 1)
Sodium azide
Bovine serum albumin (BSA)
LIVE/DEAD viability dye
Fixation buffer solution
FACS Buffer (1% bovine serum albumin, 0.5% sodium azide, and 1X PBS ph 7.2)
Trypan Blue Solution 0.4%
Fetal bovine serum
Additional Instruments
Incubator with shaker
Flow cytometer
Centrifuge
Vacuum system
Incubator
Water bath
Cell counter
Microscope

References

  1. Trowsdale, J., Betz, A. G. Mother’s little helpers: mechanisms of maternal-fetal tolerance. Nat Immunol. 7 (3), 241-246 (2006).
  2. King, A., et al. Evidence for the expression of HLAA-C class I mRNA and protein by human first trimester trophoblast. J Immunol. 156 (6), 2068-2076 (1996).
  3. Bonney, E. A., Matzinger, P. The maternal immune system’s interaction with circulating fetal cells. J Immunol. 158 (1), 40-47 (1997).
  4. Tafuri, A., Alferink, J., Moller, P., Hammerling, G. J., Arnold, B. T cell awareness of paternal alloantigens during pregnancy. Science. 270 (5236), 630-633 (1995).
  5. Chaouat, G., Petitbarat, M., Dubanchet, S., Rahmati, M., Ledee, N. Tolerance to the foetal allograft. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 624-636 (2010).
  6. Robertson, S. A., et al. Seminal fluid drives expansion of the CD4+CD25+ T regulatory cell pool and induces tolerance to paternal alloantigens in mice. Biol Reprod. 80 (5), 1036-1045 (2009).
  7. Robertson, S. A., Moldenhauer, L. M. Immunological determinants of implantation success. Int J Dev Biol. 58 (2-4), 205-217 (2014).
  8. Aluvihare, V. R., Kallikourdis, M., Betz, A. G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat Immunol. 5 (3), 266-271 (2004).
  9. Rowe, J. H., Ertelt, J. M., Xin, L., Way, S. S. Pregnancy imprints regulatory memory that sustains anergy to fetal antigen. Nature. 490 (7418), 102-106 (2012).
  10. Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict. Cell. 150 (1), 29-38 (2012).
  11. Saito, S., Sakai, M., Sasaki, Y., Nakashima, A., Shiozaki, A. Inadequate tolerance induction may induce pre-eclampsia. J Reprod Immunol. 76 (1-2), 30-39 (2007).
  12. Lee, J., et al. A signature of maternal anti-fetal rejection in spontaneous preterm birth: chronic chorioamnionitis, anti-human leukocyte antigen antibodies, and C4d. PLoS One. 6 (2), 0016806 (2011).
  13. Steinborn, A., et al. Pregnancy-associated diseases are characterized by the composition of the systemic regulatory T cell (Treg) pool with distinct subsets of Tregs. Clin Exp Immunol. 167 (1), 84-98 (2012).
  14. Gomez-Lopez, N., Laresgoiti-Servitje, E. T regulatory cells: regulating both term and preterm labor. Immunol Cell Biol. 90 (10), 919-920 (2012).
  15. Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. A., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol. 23 (10), 46 (2014).
  16. Romero, R., Dey, S. K., Fisher, S. J. Preterm labor: one syndrome, many causes. Science. 345 (6198), 760-765 (2014).
  17. Gomez-Lopez, N., Guilbert, L. J., Olson, D. M. Invasion of the leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy. J Leukoc Biol. 88 (4), 625-633 (2010).
  18. Timmons, B., Akins, M., Mahendroo, M. Cervical remodeling during pregnancy and parturition. Trends Endocrinol Metab. 21 (6), 353-361 (2010).
  19. Arck, P. C., Hecher, K. Fetomaternal immune cross-talk and its consequences for maternal and offspring’s health. Nat Med. 19 (5), 548-556 (2013).
  20. Erlebacher, A. Immunology of the maternal-fetal interface. Annu Rev Immunol. 31, 387-411 (2013).
  21. Wambach, C. M., Patel, S. N., Kahn, D. A. Maternal and fetal factors that contribute to the localization of T regulatory cells during pregnancy. Am J Reprod Immunol. 71 (5), 391-400 (2014).
  22. Cross, J. C., Werb, Z., Fisher, S. J. Implantation and the placenta: key pieces of the development puzzle. Science. 266 (5190), 1508-1518 (1994).
  23. Georgiades, P., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Comparative developmental anatomy of the murine and human definitive placentae. Placenta. 23 (1), 3-19 (2002).
  24. Croy, B. A., et al. Imaging of vascular development in early mouse decidua and its association with leukocytes and trophoblasts. Biol Reprod. 87 (5), (2012).
  25. Hofmann, A. P., Gerber, S. A., Croy, B. A. Uterine natural killer cells pace early development of mouse decidua basalis. Mol Hum Reprod. 20 (1), 66-76 (2014).
  26. Lima, P. D., Zhang, J., Dunk, C., Lye, S. J., Anne Croy, B. Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy. Cell Mol Immunol. , (2014).
  27. Robson, A., et al. Uterine natural killer cells initiate spiral artery remodeling in human pregnancy. FASEB J. 26 (12), 4876-4885 (2012).
  28. Lash, G. E., et al. Regulation of extravillous trophoblast invasion by uterine natural killer cells is dependent on gestational age. Hum Reprod. 25 (5), 1137-1145 (2010).
  29. Kruse, A., Merchant, M. J., Hallmann, R., Butcher, E. C. Evidence of specialized leukocyte-vascular homing interactions at the maternal/fetal interface. Eur J Immunol. 29 (4), 1116-1126 (1999).
  30. Degaki, K. Y., Chen, Z., Yamada, A. T., Croy, B. A. Delta-like ligand (DLL)1 expression in early mouse decidua and its localization to uterine natural killer cells. PLoS One. 7 (12), 28 (2012).
  31. Habbeddine, M., Verbeke, P., Karaz, S., Bobe, P., Kanellopoulos-Langevin, C. Leukocyte Population Dynamics and Detection of IL-9 as a Major Cytokine at the Mouse Fetal-Maternal Interface. PLoS One. 9 (9), (2014).
  32. Blaisdell, A., Erlbacher, E., Yamada, A. T., Croy, B. A., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. Ch. 53. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. , 619-635 (2014).
  33. Rinaldi, S. F., Catalano, R. D., Wade, J., Rossi, A. G., Norman, J. E. Decidual neutrophil infiltration is not required for preterm birth in a mouse model of infection-induced preterm labor. J Immunol. 192 (5), 2315-2325 (2014).
  34. Plaks, V., et al. Uterine DCs are crucial for decidua formation during embryo implantation in mice. J Clin Invest. 118 (12), 3954-3965 (2008).
  35. Parr, E. L., Szary, A., Parr, M. B. Measurement of natural killer activity and target cell binding by mouse metrial gland cells isolated by enzymic or mechanical methods. J Reprod Fertil. 88 (1), 283-294 (1990).
  36. Arck, P. C., et al. Murine T cell determination of pregnancy outcome. Cell Immunol. 196 (2), 71-79 (1999).
  37. Male, V., Gardner, L., Moffett, A. Isolation of cells from the feto-maternal interface. Curr Protoc Immunol. 7 (7), 1-11 (2012).
  38. Li, L. P., Fang, Y. C., Dong, G. F., Lin, Y., Saito, S. Depletion of invariant NKT cells reduces inflammation-induced preterm delivery in mice. J Immunol. 188 (9), 4681-4689 (2012).
  39. Collins, M. K., Tay, C. S., Erlebacher, A. Dendritic cell entrapment within the pregnant uterus inhibits immune surveillance of the maternal/fetal interface in mice. J Clin Invest. 119 (7), 2062-2073 (2009).
  40. Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Mol Reprod Dev. 75 (5), 818-827 (2008).
  41. Zhang, P., Wu, X., Hu, C., Wang, P., Li, X. Rho kinase inhibitor Y-27632 and Accutase dramatically increase mouse embryonic stem cell derivation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 48 (1), 30-36 (2012).
  42. Pang, S. C., Janzen-Pang, J., Tse, Y., Croy, B. A., Yamada, A. T., Croy, B. A., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. Ch. 2. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. , 21-42 (2014).
  43. Zenclussen, A. C., et al. Murine abortion is associated with enhanced interleukin-6 levels at the feto-maternal interface. Cytokine. 24 (4), 150-160 (2003).
  44. Mallidi, T. V., Craig, L. E., Schloemann, S. R., Riley, J. K. Murine endometrial and decidual NK1.1+ natural killer cells display a B220+CD11c+ cell surface phenotype. Biol Reprod. 81 (2), 310-318 (2009).
  45. Addio, F., et al. The link between the PDL1 costimulatory pathway and Th17 in fetomaternal tolerance. J Immunol. 187 (9), 4530-4541 (2011).
  46. Shynlova, O., et al. Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling. J Cell Mol Med. 17 (2), 311-324 (2013).
  47. Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
  48. Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. , 670-672 (2014).
  49. Quan, Y., et al. Impact of cell dissociation on identification of breast cancer stem cells. Cancer Biomark. 12 (3), 125-133 (2012).
  50. Gordon, K. M., Duckett, L., Daul, B., Petrie, H. T. A simple method for detecting up to five immunofluorescent parameters together with DNA staining for cell cycle or viability on a benchtop flow cytometer. J Immunol Methods. 275 (1-2), 113-121 (2003).

Play Video

Cite This Article
Arenas-Hernandez, M., Sanchez-Rodriguez, E. N., Mial, T. N., Robertson, S. A., Gomez-Lopez, N. Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface. J. Vis. Exp. (99), e52866, doi:10.3791/52866 (2015).

View Video