Herein we propose a strategy to study the effect of a transcription factor of interest on the microRNA transcriptome using publically available data, computational resources and high throughput data from microRNA arrays after transfecting cells with small hairpin (sh)RNA targeting a transcription factor of interest.
Terwijl de transcriptieregulatie van eiwitcoderende genen uitgebreid bestudeerd weinig bekend over hoe transcriptiefactoren betrokken zijn bij transcriptie van niet-coderende RNA's specifiek van miRNA. Hier stellen we een strategie om de mogelijke rol van transcriptiefactor studeren in het reguleren van transcriptie van microRNA's met behulp van publiekelijk beschikbare gegevens, computational resources en high throughput data. We gebruiken de H3K4me3 epigenetische handtekening aan microRNA promotors en chromatine immunoprecipitatie (ChIP) -sequencing data identificeren van de ENCODE project om microRNA promotors die zijn verrijkt met transcriptiefactor bindingsplaatsen te identificeren. Door het transfecteren van cellen plaats met shRNA gericht op een transcriptiefactor van interesse en het onderwerpen van de cellen aan microRNA array, onderzoeken we het effect van deze transcriptiefactor op de microRNA transcriptoom. Als illustratief voorbeeld gebruiken we ons onderzoek naar het effect van STAT3 op microRNA transcriptoom van chronische lymphocytic leukemie (CLL) cellen.
MicroRNAs zijn endogene kleine niet coderende RNA's regelgeving die typisch functioneren als negatieve regulatoren van mRNA expressie in het post-transcriptionele niveau. Ongeveer 1000 niet coderende 20-25 nucleotiden lang microRNA worden in het menselijk genoom 1,2. MicroRNAs genexpressie tot canonieke basenparing tussen het zaad sequentie van microRNA en zijn complementaire sequentie seed match, die gewoonlijk is gelegen aan het 3 'onvertaalde gebied (UTR) van het doelwit mRNA. Gezamenlijk microRNAs reguleren van meer dan 30% van de proteïne-coderende genen 3, maar is slechts weinig bekend over de transcriptie van DNA van microRNAs. Er is gesuggereerd dat de regulering van microRNA transcriptie vergelijkbaar met die van mRNA 4,5. Vooral vergelijkbaar met de activiteit bevorderen transcriptie van eiwitcoderende genen, transcriptie factoren zijn die de transcriptie van miRNA 6 activeert. Transcriptiefactor-microRNA samenspel is gemeld als een modulator factor van genexpressie 7, en kunnen vormen ook feed-back en feed-forward loops. Bijvoorbeeld Yamakuchi et al. Rapporteerde een terugkoppellus waarin p53 induceert de expressie van microRNA34a, waardoor remt translatie van het p53 repressor SIRT en daardoor p53 activiteit 8 toe.
Dat specifieke voorbeelden van transcriptie factor afhankelijke expressie van miRNA gemeld wordt geaccepteerd als die informatie geeft over hoe een transcriptiefactor van interesse reguleert de expressie van microRNA-transcriptoom ontbreekt. Het doel van het protocol hierin voorgesteld is om een diepgaande beschrijving van transcriptiefactor-afhankelijke regulatie van het microRNA-transcriptoom bieden. Door het combineren van publiekelijk beschikbare gegevens, bio-informatica hulpmiddelen en het gebruik van microarray technologie, zou onderzoekers die dit algoritme volgen in staat om op een genomische schaal om vast te leggen hoe eentranscriptiefactor in elk celtype van belang reguleert de expressie van microRNA-transcriptoom en een vermeende bijdrage van de transcriptiefactor mRNA verkennen in microRNA expressie reguleren.
Het mechanisme dat het RNA polymerase II de transcriptie afhankelijke eiwit-coderende genen is uitgebreid bestudeerd. Hoewel deze elementen maken slechts 1% – 2% van het menselijk genoom, bewijsmateriaal van de ENCODE project suggereren dat meer dan 80% van het menselijk genoom transcriptie 17 kan ondergaan en wat reguleert de transcriptie van de niet-coderende DNA-elementen nog zwaar 6 .
Verschillende studies waaruit bleek dat Pol II is ook verantwoordelijk voor de tra…
The authors have nothing to disclose.
Deze studie werd ondersteund door een subsidie van de CLL Global Research Foundation. De Universiteit van Texas MD Anderson Cancer Center wordt gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health door middel van een Cancer Center Ondersteuning Grant (P30CA16672).
Lipofectamin 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
0.45 um syringe filter | Thermo Scientific (Nalgene) | 190-2545 | |
Amicon ultracentrifugal filter device with threshold of 100kDa | Merck Millipore | ||
Polybrene | Merck Millipore | TR-1003-G | |
TRIzol reagent | Life Tachnologies (Invitrogen) | 15596-026 | |
293 Cell line human | Sigma-Aldrich | 85120602 |