Décrire un règlement dépendant du facteur de transcription de l'microARN transcriptome
Summary
Herein we propose a strategy to study the effect of a transcription factor of interest on the microRNA transcriptome using publically available data, computational resources and high throughput data from microRNA arrays after transfecting cells with small hairpin (sh)RNA targeting a transcription factor of interest.
Abstract
Alors que la régulation de la transcription des gènes codant des protéines a été largement étudié, on sait peu sur la façon dont les facteurs de transcription sont impliqués dans la transcription des ARN non-codant, en particulier des microARN. Ici, nous proposons une stratégie pour étudier le rôle potentiel du facteur de transcription dans la régulation de la transcription des microARN en utilisant des données publiquement disponibles, les ressources de calcul et de données à haut débit. Nous utilisons la signature épigénétique H3K4me3 pour identifier les promoteurs de microARN et immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) données -sequencing du projet ENCODE pour identifier les promoteurs de microARN qui sont enrichis avec des sites de liaison du facteur de transcription. Par transfection de cellules d'intérêt avec shRNA ciblant un facteur de transcription d'intérêt et à soumettre les cellules à matrice microRNA, nous étudions l'effet de ce facteur de transcription sur le transcriptome microARN. A titre d'exemple illustratif, nous utilisons notre étude sur l'effet de STAT3 sur le transcriptome microRNA de ly chroniqueleucémie mphocytic (CLL) cellules.
Introduction
Les microARN sont de petits ARN régulateurs non codantes endogènes qui fonctionnent généralement comme des régulateurs négatifs de l'expression de l'ARNm au niveau post-transcriptionnel. Environ 1000 non codante entre 20 et 25 nucléotides de long microARN sont présents dans le génome humain 1,2. Les microARN régulent l'expression des gènes par appariement de bases canonique entre la séquence de semence de la microARN et sa séquence de match de semences complémentaire, qui est généralement situé à la région 3 'non traduite (UTR) des ARNm cibles. Collectivement, les microARN réglementent plus de 30% des gènes codant des protéines 3, mais seulement on connaît peu la transcription de l' ADN de microARN. Il a été suggéré que la régulation de la transcription microARN est similaire à celle de l' ARNm de 4,5. En particulier, celle de son activité dans la promotion de la transcription des gènes codant pour des protéines, des facteurs de transcription sont censés activer la transcription de microARN 6. Facteur de transcription microRNA jeu a été rapporté comme un facteur de modulation de l' expression génique 7, et peut également former un feed-back et des boucles feed-forward. Par exemple, Yamakuchi et al. A rapporté une boucle de rétroaction dans laquelle p53 induit l'expression de microRNA34a, qui à son tour inhibe la traduction de la p53 SIRT répresseur et d' accroître ainsi l' activité de p53 8.
Alors que des exemples spécifiques de facteur de transcription expression dépendante de microARN ont été signalés, une méthode acceptée qui fournit des informations sur la façon dont un facteur de transcription d'intérêt régule l'expression du microARN-transcriptome fait défaut. Le but du protocole proposé ici est de fournir une description détaillée de la réglementation des facteurs dépendant de la transcription du microARN-transcriptome. En combinant les données publiquement disponibles, les outils bioinformatiques et en utilisant la technologie des puces à ADN, les chercheurs qui suivent cet algorithme seraient en mesure de capturer sur une échelle génomique comment unfacteur de transcription dans tout type cellulaire d'intérêt régule l'expression du microARN-transcriptome et d'explorer une contribution putatif du facteur de transcription de l'ARNm dans la régulation de l'expression de microARN.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le mécanisme sous-jacent l'ARN polymérase dépendante II- transcription des gènes codant des protéines a été largement étudiée. Bien que ces éléments ne représentent que 1% – 2% du génome humain, la preuve du projet ENCODE suggèrent que plus de 80% du génome humain peut subir la transcription 17 et ce qui régule la transcription des éléments d'ADN non codantes reste largement inconnue 6 .
Plusieurs études, qui indiquaient que Pol II est égalem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par une subvention de la Fondation mondiale de recherche CLL. L'Université du Texas MD Anderson Cancer Center est soutenu en partie par les Instituts nationaux de la santé par le biais d'un centre d'assistance Grant Cancer (P30CA16672).
Materials
| Lipofectamin 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| 0.45 um syringe filter | Thermo Scientific (Nalgene) | 190-2545 | |
| Amicon ultracentrifugal filter device with threshold of 100kDa | Merck Millipore | ||
| Polybrene | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| TRIzol reagent | Life Tachnologies (Invitrogen) | 15596-026 | |
| 293 Cell line human | Sigma-Aldrich | 85120602 |
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