Beschreiben ein Transkriptionsfaktor abhängige Regulation der MicroRNA Transkriptom
Summary
Herein we propose a strategy to study the effect of a transcription factor of interest on the microRNA transcriptome using publically available data, computational resources and high throughput data from microRNA arrays after transfecting cells with small hairpin (sh)RNA targeting a transcription factor of interest.
Abstract
Während die Transkriptionsregulation der Protein-kodierenden Gene ausgiebig untersucht wurde, ist nur wenig bekannt darüber, wie Transkriptionsfaktoren in der Transkription von nicht-kodierenden RNAs beteiligt sind, insbesondere von Mikro-RNAs. Hier schlagen wir eine Strategie, um die potentielle Rolle des Transkriptionsfaktors zu studieren an der Transkription von microRNAs regulieren öffentlich verfügbaren Daten, Rechenressourcen und hohem Durchsatz Daten. Wir verwenden die epigenetischen Signatur H3K4me3 zu microRNA Promotoren und Chromatinimmunpräzipitation (Chip-) -sequencing Daten aus dem ENCODE-Projekt identifizieren zu microRNA Promotoren zu identifizieren, die mit Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen angereichert sind. Durch Transfektion von Zellen von Interesse mit shRNA einen Transkriptionsfaktor von Interesse und Aussetzen der Zellen an microRNA Array Targeting untersuchen wir die Wirkung dieses Transkriptionsfaktors auf der microRNA Transkriptom. Als anschauliches Beispiel verwenden wir unsere Studie über die Wirkung von STAT3 auf der microRNA Transkriptom der chronischen lymphocytic Leukämie (CLL) Zellen.
Introduction
MicroRNAs sind endogene kleine, nicht kodierende regulatorische RNAs, die typischerweise als negative Regulatoren der mRNA-Expression auf der posttranskritionelle Ebene funktionieren. Etwa 1000 nicht-codierende 20 bis 25 Nucleotide langen mikroRNAs im menschlichen Genom zu finden sind 1,2. MicroRNAs regulieren die Genexpression durch kanonische Basenpaarungen zwischen dem Keimsequenz des mikroRNA und sein komplementärer seed Übereinstimmung Sequenz, die üblicherweise am 3'-untranslatierten Region (UTR) der Ziel-mRNAs befindet. Zusammenfassend regulieren mikroRNAs mehr als 30% der Protein – codierenden Gene 3, aber nur wenig über die Transkription von DNA von mikroRNAs bekannt. Es wurde vorgeschlagen, dass die Regulation der Transkription MikroRNA , die der mRNA 4,5 ähnlich ist. Insbesondere ähnlich wie seine Aktivität Transkription von Protein – kodierenden Gene bei der Förderung, sind Transkriptionsfaktoren gedacht 6 Transkription von microRNAs zu aktivieren. Der Transkriptionsfaktor-microRNA Zusammenspiel wurde als Modulator Faktor der Genexpression 7, berichtet und kann auch Feedback- und Feedforward – Schleifen bilden. Zum Beispiel Yamakuchi et al. Berichteten von einer Rückkopplungsschleife , in der p53 die Expression von microRNA34a induziert, die wiederum Translation des p53 – Repressor SIRT hemmt und dadurch Erhöhung p53 Aktivität 8.
Während spezifische Beispiele von Transkriptionsfaktor-abhängige Expression von microRNAs berichtet worden, die eine anerkannte Methode, um Informationen darüber, wie ein Transkriptionsfaktor von Interesse reguliert die Expression des microRNA-Transkriptom bietet fehlt. Der Zweck des Protokolls hier vorgeschlagen ist, eine eingehende Beschreibung der Transkriptionsfaktor-abhängige Regulation der microRNA-Transkriptom zu liefern. öffentlich verfügbaren Daten, Bioinformatik-Tools Durch die Kombination und Microarray-Technologie, die Forscher, die diesen Algorithmus folgen zu erfassen wäre in der Lage zu einer genomischen Maßstab, wie jederTranskriptionsfaktor in jedem Zelltyp von Interesse reguliert die Expression des microRNA-Transkriptom und ein mutmaßliches Beitrag des Transkriptionsfaktors-mRNA bei der Regulierung der microRNA Ausdruck zu erkunden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Mechanismus der RNA-Polymerase II- abhängige Transkription von Protein-codierenden Genen zugrunde liegenden wurde ausgiebig untersucht. Während diese Elemente nur 1% ausmachen – 2% des menschlichen Genoms, Beweise aus dem ENCODE – Projekt legen nahe , dass mehr als 80% des menschlichen Genoms 17 Transkription unterzogen werden kann und was reguliert die Transkription der nicht-kodierenden DNA – Elemente , bleibt weitgehend unbekannt 6 .
Mehrere Studien, die zeigte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde unterstützt durch einen Zuschuss von der CLL Global Research Foundation unterstützt. Die University of Texas MD Anderson Cancer Center wird zum Teil durch die National Institutes of Health durch ein Cancer Center Support-Grant (P30CA16672) unterstützt.
Materials
| Lipofectamin 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| 0.45 um syringe filter | Thermo Scientific (Nalgene) | 190-2545 | |
| Amicon ultracentrifugal filter device with threshold of 100kDa | Merck Millipore | ||
| Polybrene | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| TRIzol reagent | Life Tachnologies (Invitrogen) | 15596-026 | |
| 293 Cell line human | Sigma-Aldrich | 85120602 |
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