Generation und Kultur der Blut Outgrowth Endothelzellen aus menschlichen peripheren Blut-

Summary

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

Abstract

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

Introduction

Bis vor kurzem wurde die postnatale Generation von neuen Blutgefäßen vermutlich ausschließlich durch einen Prozess bekannt als Angiogenese, definiert als das Sprießen neuer Schiffe von den Endothelzellen der bereits bestehenden Gefäßen auftreten. ¹ Dieses Verfahren steht im Gegensatz aus der Vaskulogenese oder die de novo Bildung von Blutgefäßen von endothelialen Vorläuferzellen, die gedacht wurde, um während der Embryogenese ausschließlich auftreten. ² Allerdings haben neuere Studien identifiziert und isoliert zirkulierenden endothelialen Vorläuferzellen (EPCs) im peripheren Blut von Erwachsenen. Diese Zellen besitzen die Fähigkeit, in der Kultur zu reifen Endothelzellen differenzieren und sind vermutlich in der postnatalen Vaskulogenese zu beteiligen. ^3,4

Protokolle für die Isolierung und Expansion dieser EPCs beinhalten üblicherweise die Kultur von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMNC) in Medien, die endotheliale Wachstumsfaktoren, einschließlich vascular endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) und Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2. ^5-8 EPC Kulturen produzieren eine Vielzahl von stark unterschiedlichen Zelltypen. Anfängliche Kulturen (<7 Tage) sind durch eine Monozyten-Zelltyp, in der Literatur als "früh" EPCs bekannt dominiert. Trotz ihres Namens exprimieren diese Zellen des Monozyten-Marker CD14, negativ für die Vorläufermarker CD34 und exprimieren nur geringe Niveaus der klassischen endotheliale CD31 und VEGF-Rezeptor-2 (VEGFR2). ^{5 Fortsetzung} Kultur führt zu einer sekundären Population von Zellen, erst Auswuchs EPCs oder Blut Auswuchs Endothelzellen (BOECs), die als diskrete Kolonien von Endothel-ähnlichen Zellen erscheinen bekannt. Im Gegensatz zu den monozytären frühen EPCs, BOECs, die auch endotheliale Kolonie-bildenden Zellen (ECFCs), Auswuchs Endothelzellen oder spät Auswuchs Endothelzellen aufgerufen haben, zeigen Sie die Kopfsteinpflastermorphologie, die typisch für endotheliale Zellmonoschichten ist und in Oberflächenmarker sehr ähnlich5 und Genexpression ^{9 bis} Endothelzellen reifen.

Die Erzeugung von Endothel-ähnlichen Zellen aus peripherem Blut bietet mehrere Vorteile, insbesondere für die Untersuchung der Endothelzelldysfunktion mit vaskulären Erkrankungen, wie pulmonaler arterieller Hypertonie (PAH) ^{10 oder} von Willebrand-Krankheit. ¹¹ Vor der Verfügbarkeit von BOECs, Endothelzellen assoziiert Zellen konnte nur von verpflanzten Organen zum Zeitpunkt des Todes oder der Organtransplantation oder isolierte aus der Nabelschnurvene Geburts ableiten. Dies reduziert die Verfügbarkeit eine ernsthafte Beschränkung auf das Verständnis der Biologie von endothelialen Zellen von Patienten mit Herzkreislauferkrankungen, sowie die Wechselwirkungen zwischen Endothelzellen und entweder Blutzellen oder Wandzellen. Ferner das Isolieren und Kultivieren einer reinen Population von Endothelzellen aus diesen Quellen ist technisch anspruchsvoll, und die Zellen mit diesen Verfahren abgeleitet zeigen nur eine limited proliferative Kapazität. BOECs bieten daher einen wertvollen Ersatz für die Isolierung und Kultivierung von Patienten stammende primäre Endothelzellen.

Zusätzlich zu ihrer in-vitro-Anwendungen sind BOECs potentiell auch in autologe Zelltransplantationstherapien nützlich. Diese Anwendungen sind sowohl Endothelzelltransplantation zur Gefäßneubildung (siehe ^{12 und} Referenzen darin) zu fördern, sowie die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen). ¹³ BOEC stamm iPSCs können für Krankheit Modellierung verwendet werden und bieten ein enormes Potenzial als Ausgangs Material für die autologe Zelltherapien. BOECs umprogrammieren schneller und mit einem höheren Wirkungsgrad als Haut-Fibroblasten. Außerdem BOECs auch für die Erzeugung von iPS-Zellen, die frei von karyotypischen Anomalien, die ein wesentliches Merkmal jeder Technologie, die sich für translationale Anwendungen sein wird, ist es zu ermöglichen. Die Fähigkeit, iPSCs von einem Patienten eine Blutprobe zu erzeugenlso eliminiert die Notwendigkeit für ein Hautbiopsie und die Erzeugung von Hautfibroblasten, wodurch die Erzeugung von Zellen zur Erleichterung von Patienten mit Wundheilungsstörungen oder sehr jungen.

Die unten beschriebenen Protokoll durch genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien des National Research Ethics Service Committee (East of England) durchgeführt wird, bietet eine einfache und zuverlässige Methode für die Erzeugung von BOECs mit mehr als 90% Wirkungsgrad aus einem relativ kleinen Volumen (60 ml) aus dem peripheren Blut. Diese Zellen sind stark proliferative und kann wiederholt agiert werden, was zur Erzeugung von Hunderten von Millionen von Zellen aus einer einzelnen Blutprobe.

Protocol

Ein Schema des BOEC Erzeugungsprotokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. 1. Blutentnahme und Dichte-Zentrifugation Für jeden Spender 3 ml Natriumcitrat, um jeden von zwei 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen. Sammeln Sie 60 ml Blut durch Venenpunktion und 30 ml in jedes Röhrchen. Kehren sanft 2-3 Mal zu mischen. Verwenden weniger als 40 ml Blut in das Protokoll, mit Citrat Volumina entsprechend eingestellt. HINWEIS: Es ist wichtig, dass Blutproben werden innerhalb von 2 h Kollektion verarbeitet. Verzögerte Verarbeitung von Blut führt zu einer deutlichen Reduktion der Auswuchs Kolonie Ausbeute. Bereiten Sie neue konische Röhrchen, die Dichtegradientenzentrifugation Medium durch erste Umdrehen der Flasche mehrmals, um zu mischen. In einer sterilen Haube 15 ml Dichtegradientenzentrifugation Medium pro 50 ml konische Röhrchen (1 Röhrchen pro 10 ml Blut, 6 Röhrchen pro Spender). Verdünnte Blut 1: 1 mit Dulbecco-Phosphat-gepufferten Saline (DPBS). Kippen der Röhrchen mit dem Dichtegradientenzentrifugation Medium zu einem Winkel von 20 ° mit der Arbeitsfläche. Mit einer Pipette Hilfe und eine 25 ml serologische Pipette langsam Schicht 21 ml verdünntes Blut auf dem Medium durch allmähliche Zugabe von Blut auf der Wand der geneigten Röhre. HINWEIS: Dadurch wird Mischung des Blutes mit dem Dichtegradienten Schicht zu minimieren und eine engere Buffy-Coat sowie eine verbesserte Ausbeute herzustellen. Zentrifuge Proben bei 400 × g für 35 min bei RT mit dem Gaspedal und der Bremse ausgeschaltet. Während dieser Zentrifugation Zeit beginnen die Kollagenbeschichtung in den Schritten 2.1 detailliert – 2.4. Achten Sie darauf, diese Schritte, bevor zu Schritt 3.1 abgeschlossen. 2. Kollagenbeschichtung der T-75-Kolben und Vorbereitung des Kulturmediums HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte in einer Zellkultur Kapuze. Bereiten Sie eine 50 ug / ml Kollagenlösung durch Verdünnen Lager TyPE I-Kollagen in 10 ml 0,02 M Essigsäure. Beispiel: für Kollagen Lager in einer Konzentration von 4,05 mg / ml, so 123,5 ul Kollagen zu 10 ml 0,02 M Essigsäure. Sterilfilter Kollagensuspension vor der Verwendung. Verwendung einer serologischen Pipette 7,5 ml Kollagenlösung mit einem T-75-Zellkulturflasche. Dieses Volumen gibt 5 ug Kollagen / cm 2 (oder 375 & mgr; g / Kolben). Mantel Kolben für 1 h bei RT. Bereiten Sie das Hinzu endothelialen Grundmedium mit den Wachstumsfaktor Ergänzungen durch den Hersteller zur Verfügung gestellt für BOEC Erzeugung verwendet endothelialen Wachstumsmedium. Fügen Sie alle Ergänzungen, aber nicht Serum hinzuzufügen. Vorzubereiten 15 ml Erzeugungsmedium BOEC, fügen 2,5 ml definiert fötalem Rinderserum (FBS) zu 12,5 ml Endothelwachstumsmedium den Wachstumsfaktor enthaltenden Präparate. Fahren Sie mit den Schritten in Abschnitt 3 skizzierten Nach 1 Std Beschichtungszeitraum absaugen Kollagenlösung und abwaschen restliche Essigsäure durch Pipettierenin 10 ml DPBS. Absaugen des DPBS und wiederholen Sie diesen Waschschritt noch einmal. Wenn die im Schritt 3.3 erhaltene Zellsuspension ist nicht bereit für die Beschichtung zu dieser Zeit, fügen Sie 5 ml Generation mittel BOEC in den Kolben, um die Kollagenbeschichtung vor dem Austrocknen zu halten. 3. Erhebung und Oberflächen von PBMNCs Im Anschluss an die Dichtegradientenzentrifugation in Schritt 1.4 beschrieben, sorgfältig sammeln die Buffy-Coat-Schicht unter Verwendung eines sterilen Plastiktransferpipette. Sammeln der buffy coat sollte etwa 20 ml Zellsuspension und Plasma aus jedem Röhrchen zu ergeben. Vermeiden Sie die Übertragung der Dichtegradienten-Medium. Verdünnen Sie die mononukleäre Zellsuspension 1: 1 in DPBS und invertieren zu mischen. Zentrifuge bei RT für 20 min bei 300 xg mit Bremse und Gaspedal bei max. Nach der Zentrifugation den Überstand aspirieren und resuspendieren Zellen, die durch Zugabe von 1 ml Generation mittel BOEC zu jedem Pellet und Auf-und Abpipettieren mehrmals. Pool Zellsuspensionen eind nachfüllen Gesamtvolumen auf 10 ml mit dem restlichen Medium. Um eine Schätzung der Gesamtzellzahl, Probe 10 ul Zellsuspension zu erhalten und zu verdünnen 50x mit 490 ul der Türken Lösung, die roten Blutkörperchen zu lysieren wird. Gehören eine 10 ul Probe des verdünnten Zellsuspension unter Verwendung eines Hämozytometers. HINWEIS: 60 ml Blut sollte etwa 100-150 x 10 6 weißen Blutkörperchen für die Beschichtung zu erhalten. Platte gesamte Zellsuspension in einer einzigen, mit Kollagen beschichteten T-75-Kolben, top-up Mittelvolumen auf 15 ml / Kolben und die Kultur bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2. Zellen zu diesem Zeitpunkt überzogen darstellen Gang 0. Anmerkung: Es ist möglich, die isolierten PBMNC vor BOEC Isolierung um die BOECs zu einem späteren Zeitpunkt oder um die PBMNC in ein anderes Labor, in dem die BOECs erzeugt werden transportieren abzuleiten einzufrieren. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass das Einfrieren PBMNCs könnte die Effizienz BOEC Isolierung reduzieren. See Abschnitt 8 unten Methode. 4. Langfristige Zellkultur Ändern Medium alle 2 Tage durch Zugabe von 15 ml frischem BOEC Erzeugungsmedium (5: 1-Mischung von endothelialen Zellwachstumsmedium und definierte FBS). Für Wochenenden können Medium Änderungen alle 3 Tage verzögert werden. HINWEIS: Outgrowth Kolonien sollte zwischen 7 und 14 Tagen der Kultur angezeigt. Überwachen die BOEC Kulturflasche an den Tagen 7-14 für das Auftreten der Folge Kolonien. Identifizieren Kolonien als kreisförmige Gruppen von Zellen, die einen klassischen endothelialen Kopfsteinpflastermorphologie. Nachdem eine Kolonie oder mehreren Kolonien werden in den Kolben identifiziert, mit mittleren Veränderungen weiter und lassen Sie Kolonien auf etwa 1000 bis 2000 Zellen pro Kolonie vor Passagieren wachsen. Bestimmen Sie die Zellzahl pro Volk durch eine schwierige visuelle Schätzung. ANMERKUNG: Als Richtlinie üblich, Durchgang Anfangs Auswuchs Kolonien eine Woche nach der Identifizierung des ersten Auswuchs Kolonie ist es. <li> Passage Zellen durch Spülen Kolben zweimal mit 10 ml DPBS. 5 ml 1X Trypsin-EDTA und Inkubation in einem Inkubator bei 37ºC für 5 min. Nach 5 min, zu neutralisieren Trypsin mit 10 ml Medium (enthaltend FBS) und bringen Zellen in Suspension mit wiederholten Pipettieren. Zentrifuge Suspension bei 300 xg für 5 min, resuspendieren in 15 ml frischem BOEC Erzeugungsmedium und der Platte gesamte Zellsuspension in einen neuen T-75-Kolben (entspricht Passage 1, P1). Keine Kollagenbeschichtung erforderlich. Weiterhin Mediums ändert, wie oben beschrieben, bis die Zellen konfluent (ungefähr 3-5 x 10 6 Zellen pro Kolben). Sobald konfluent, Passage-Zellen, wie in Schritt 4.3 beschrieben. HINWEIS: Von Durchgang 2 ab, Zellen nicht mehr benötigen Generation mittel BOEC und kann in endothelialen Zellwachstumsmedium und 10% Standard-hitzeinaktiviertem FBS kultiviert werden. Collagen Beschichtung kann als ein optionaler Schritt für die Zukunft genutzt werden, denn es gibt Hinweise darauf, dass die Anwesenheit von Kollagen kann BOEC prolifer verbessernation Raten. Für die weitere Passage, Platte nicht weniger als 750.000 Zellen pro T-75-Kolben so niedrig Zelldichten kann dazu führen, die BOECs zu stoppen vermehren. 5. Einfrieren und Auftauen BOEC Kulturen Trypsinize Zellen, wie in Abschnitt 4.3 und Zentrifuge bei 300 xg für 5 min beschrieben. Saugt den Überstand und resuspendiere in 10 ml Medium. Dies erfordert nicht endothelialen Zellwachstumsmedium; DMEM mit 10% FBS-Standard genügt. Sammeln eine 10 ul-Probe der Zellsuspension, um eine manuelle Zellzählung unter Verwendung eines Hämozytometers durchzuführen. Zentrifuge wieder und resuspendieren in 2×10 6 Zellen / ml in eiskaltem Kryokonservierung Medium (40% DMEM mit 50% FBS und 10% DMSO). 0,5 ml (10 6 Zellen) zu jedem Gefäß, place Fläschchen in einer eiskalten Isopropanol Kryokonservierung Gefäß entnommen und in einen -80 ° C im Gefriergerät für mindestens 2 h vor der Übertragung an flüssigem Stickstoff. Lassen Sie keine Zellen bei -80 ° C für mehr als 24 Stunden. </li> Zum Auftauen Zellen, 10 ml vorgewärmten Medium zu einem 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen. HINWEIS: Wenn Auftauen Passage 1-Zellen aufgetaut, in endothelialen Zellwachstumsmedium mit definiertem FBS für die ersten 2 Tage nach dem Auftauen 20% ergänzt wird. Dies führt zu einer stabileren Zellisolierung für die Zukunft. Zellen, die aus flüssigem Stickstoff und Auftauen in einem 37 ° C Wasserbad unter leichtem Rühren zu entfernen, bis nur ein kleiner Eiskristalle in der Durchstechflasche. Geben Sie den Inhalt des Fläschchens tropfenweise zu der konischen Zentrifugenröhrchen und Spin bei 300 g nach unten für 5 Minuten. Überstand wird abgesaugt und resuspendieren Zellpellet in 10 ml EGM-2MV + 10% FBS. In den T-75-Kolben und Top-up-Medium auf 15 ml. 6. Charakterisierung der BOECs durchflusszytometrisch Sobald die in Abschnitt 4 beschrieben BOEC Kolonien erlaubt worden, zu erweitern, trypsinize Zellen, wie in Abschnitt 4.4 und resuspendieren in einer Konzentration von 10 6 Zellen pro ml in Färbepuffer beschrieben (DPBS with 2% FBS und 2 mM EDTA). Kombinieren Sie 10 5 Zellen mit einem Fluorochrom konjugierte Antikörper gegen CD45, CD14, CD34, CD31 (Nutzung aller bei 1:20 Verdünnung) oder VEGFR2 (verdünnen 1:10) gerichtet (siehe Tabelle 1 für weitere Informationen). Inkubation für 30 min bei 4 ° C im Dunkeln. Zellen mit 1 ml Färbung Puffer und Zentrifuge bei 300 xg für 5 min waschen. Überstand wird abgesaugt und resuspendieren in 400 & mgr; l Färbepuffer für die Analyse. Halten Zellen bei 4 ° C und vor Licht vor der Analyse geschützt. Zuführen zytometrische Analyse auf einem Durchflusszytometer ausgestattet, um die Fluoreszenz-konjugierte Antikörper in dem Assay verwendet detektieren. Verwenden einen ungefärbten BOEC Probe, um die Zellpopulation am Zytometer durch Einstellen Vorwärts- und Seitenstreuspannungen sowie die Spannungen für die FITC und APC-Kanäle zu identifizieren. Bestimmen Sie Gating Schwellen mit Isotyps gefärbten Zellen für jedes Fluorochrom. Beurteilen Positivität für jeden Zelloberflächenmarker auf der Grundlage der Presence einer Spitzenverschiebung der Fluoreszenz-Intensität gegen die Isotyp-Kontrolle für die Fluorochrom analysiert. 7. Charakterisierung BOECs durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie Platte BOECs in einer 24-Well-Flachboden-Gewebekulturplatte ohne Deckgläser in einer Dichte von 5 × 10 4 Zellen in 500 ul endothelialen Zellwachstumsmedium + 10% hitzeinaktiviertem FBS pro Vertiefung und lassen Sie sich an und wachsen bei 37 ° C, 5% CO 2, bis die Zellen umfasst mindestens 70-80% der Oberfläche von jeder Vertiefung (Schätzung Konfluenz durch visuelle Untersuchung unter einem Lichtmikroskop). Wash-Zellen in jeder Vertiefung für 5 Minuten mit 1 ml DPBS. Fixieren Zellen O / N bei 4 ° C mit 500 ul 4% Paraformaldehydlösung in DPBS. Wash-Zellen für 3 x 5 min mit 1 ml DPBS pro Vertiefung. Hinzufügen und entfernen Sie die DPBS mit einer Pipette und eine Wasserstrahlpumpe verbunden. Permeabilisieren Zellen für 3 x 10 min mit 0,2% Polysorbat 20 in DPBS. </li> Inkubieren Zellen für 1 h bei RT in Blocking-Puffer, enthaltend 10% FBS in DPBS. Fleckzellen bei 4 ° CO / N in 300 ul Antikörperverdünnungspuffer (0,1% Rinderserumalbumin in DPBS) mit primären Antikörpern gegen CD34 (10 ug / ml), CD144 gerichtet ist (1: 300) oder vWF (1: 250) . Siehe Tabelle 1 für weitere Informationen. Abwaschen ungebundenen primären Antikörpern für 5 x 10 min mit DPBS. Inkubieren Zellen für 1 h bei RT mit dem entsprechenden fluoreszenz-markierten Sekundärantikörper, wie in Tabelle 1 (alle bei einer 1: 200) beschrieben. Abwaschen ungebundenen Sekundärantikörper für 5 x 10 min mit DPBS. Inkubieren Zellen mit 1 & mgr; g / ml 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in DPBS für 10 min bei RT. Wasche die Zellen mit DPBS weitere 3 x 5 min. Bildzellen bei 100-facher Vergrößerung mit einem inversen Mikroskop mit einer externen Lichtquelle für die Fluoreszenzanregung ausgestattet, und die Aufnahmen mit einem befestigened Digitalkamera zur nachfolgenden Analyse offline. 8. Einfrieren und Auftauen PBMNCs Am Ende der Stufe 3.2, wird nach der Zentrifugation absaugen Medium und das Zellpellet bei wiederholter Auf- und Abpipettieren mit einer P1000 Pipettenspitze manuell unterbrechen. 1 ml Gefriermedium, 90% Serum und 10% DMSO, achten Sie darauf, vorsichtig mischen, um eine Zellsuspension herzustellen. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine Kryoröhrchen und Einfrieren und Auftauen, wie in Abschnitt 5 beschrieben.

Representative Results

Isolierung von Leukozytenmanschette mononuklearen Zellen von 60 ml Blut in der Regel ergibt 100-150×10 6 Gesamtzahl der weißen Blutkörperchen. Wenn sie in einer einzigen T-75-Kolben ausplattiert, die große Anzahl von Zellen in der nicht-lysierten Zellsuspension macht es schwierig, einzelne anhaftende Zellen zu lösen unter Verwendung von Hellfeldmikroskopie. Wiederholte Medium Veränderungen resultieren im Abstand von nicht-adhärenten Zellen und ermöglichen die Visualisierung der adhärenten Population von monozytären "frühen" EPCs. Am Tag 7 werden die T-75 etwa 7×10 6 dieser länglichen adhärenten Zellen. Von Tag 7 bis 14 sollten Kolonien BOECs innerhalb des Kolbens (2A) angezeigt. Colonies ersten erscheinen als 3 bis 5 benachbarten Zellen. Auswuchs Koloniezahl kann von 1 bis 10 Kolonien pro 60 ml Blut variieren. Allgemeiner jüngeren Spendern (dh 20-25 Jahre alt) dazu neigen, eine größere Anzahl von Auswuchs Kolonien, die auch weiter oben in Kultur erscheinen zu erzeugen.BOECs vermehren sich von diesem zentralen Gruppe von Zellen, um kreisförmige Kolonien, bestehend aus mehreren hundert Zellen zu bilden. Zellen innerhalb dieser Kolonien weisen eine klassische endothelialen Kopfsteinpflastermorphologie. Es ist bevorzugt, um den Durchgang Anfangs Kolonien, wenn sie etwa 1000 Zellen pro Kolonie enthalten. Auswuchs Kolonien zu erreichen in der Regel diese Größe, 7 Tage nachdem ihr ursprüngliches Aussehen in der Kultur. Sobald die ursprünglichen Kolonien werden in einen neuen T-75-Kolben agiert, sollten sie sich vermehren, um eine konfluente Monoschicht (3-5×10 & sup6; Zellen pro Flasche) innerhalb von 5 Tagen oder weniger (2B) zu bilden. In einem kleinen Prozentsatz der Isolierungen (<10%), Auswuchs Kolonien ausbleiben, oder nicht ausreichend nach dieser ersten Passage Schritt vermehren. BOECs, die niedrige Proliferation nach der ersten Passage aufweisen gehen selten auf eine stabile BOEC Isolierungen werden und oft anhalten wuchernden innerhalb von zwei bis drei Passagen. Die Monozyten-EPCs früh innerhalb der BOEC Kulturen enthielten nicht-proliferative und werden typischerweise aus den Kulturen in 1-2 Durchgängen gelöscht wird. Clearance dieser frühen Zellen aufgrund Zelltod, Versagen der frühen Zellen erneut haften nach Passagierung und Verdünnung der nicht-proliferative frühen EPCs mit wiederholte Passagen. Passage 1 Zellen können entweder weiter in Kultur agiert oder unten für eine spätere Verwendung eingefroren werden. Nachdem eine stabile Isolierung erzeugt wird, können die Zellen mit einer Geschwindigkeit von 1 konfluente Kolben auf 3-5 neue T-75-Kolben bis zum Durchgang 8 oder 9, bevor er Ruheagiert werden. Auch hier ist die Zelldichte im gesamten Kultur kritisch. Nach unserer Erfahrung sollte nicht weniger als 750.000 Zellen in einer T-75-Kolben plattiert werden, da niedrigere Zelldichten können Wachstumsstillstand verursachen. Trotz der hohen proliferative Potenzial von BOECs sollten die Zellen auch nicht gestattet, overconfluent werden (dh.,> 5×10 6 Zellen pro Kolben), da dies dazu führen convers Ion BOECs zu einem nicht-proliferativen Phänotyp. Wir schlagen vor, dass jede Zelle markiert als BOEC sollten geeignete Zelloberfläche und die intrazelluläre Färbung für endotheliale Marker angezeigt. Charakterisierung BOECs durch Durchflusszytometrie (Figur 3) oder Fluoreszenzmikroskopie (Figur 4) erzielt werden, nach Anfärbung für typische Endothelzellmarkern. BOECs sind positiv für die endotheliale Oberflächenmarker CD31 und VEGFR2 und negativ für die Monozyten-Marker CD14 und dem pan-Leukozytenmarker CD45. BOECs posess auch Weibel-Palade-Körperchen und damit zum Ausdruck bringen Willebrand-Faktor (vWF) als diskrete, punktförmige zytoplasmatische Färbung. Im Gegensatz zu anderen reifen Endothelzellen-Typen, wie Lungenarterie oder Aorta-Endothelzellen, BOECs auch Ausdruck der Stammvater und Aktivierungsmarker CD34 auf ihrer Oberfläche. ftp_upload / 53.384 / 53384fig1.jpg "/> Abbildung 1 Schematische Darstellung der BOEC Erzeugungsprotokoll. Periphere mononukleäre Blutzellen werden aus Venenblut durch Dichtegradienten-Zentrifugation isoliert und kultiviert auf Kollagen-beschichteten Platten in endothelialen Wachstumsmedium definiert FBS. BOEC Kolonien innerhalb von 7-14 Tagen der Kultur angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 2. Hellfeldbilder des Vertreters BOEC Kulturen. (A) Outgrowth Kolonien erscheinen in Kulturen zwischen den Tagen 7 und 14 Kolonien als Sammlungen von Endothel-ähnlichen Zellen, die in einer gepflasterten Monolage angeordnet sind und sich vermehren radial von einer zentralen Stelle vorhanden ist. Rund um das Auswachsen Kolonien sind die adhärenten Monocytic Zellen, die in frühen Kulturen machen die überwiegende Mehrheit der Zellen. Diese Zellen, die zuvor als "frühe" endothelialen Vorläuferzellen, haben eine spindelförmige Morphologie und exprimieren das Monozyten-Marker CD14. (B) Im Anschluss an Passagieren, die hoch proliferative BOECs über Kulturen zu nehmen, da die nicht-proliferative Monocytenzellen entweder absterben oder nicht wieder anzubringen, nachdem Passagieren. Maßstabsleiste 250 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 3. Charakterisierung BOECs mittels Durchflusszytometrie. BOECs wurden trypsinisiert und mit Fluoreszenz-konjugierten Isotypkontrolle Antikörper (grau gefüllte Spitze) oder Antikörper gegen spezifische Oberflächenmarker (rote Linie) gerichtete gefärbt. Oberflächenmarker für cytometric Charakterisierungumfassen die hämatopoetischen Marker CD45 und CD14, die endotheliale Marker CD31 und VEGFR2 und die progentior und Endothelzellen Aktivierungsmarker CD34. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 4. Immunfluoreszenzfärbung von BOECs für Endothelzellmarkern. Repräsentative Immunfluoreszenzbilder von BOECs immunhistochemisch mit Antikörpern gegen endothelialen Zelloberflächenmarker CD144 gerichtet (VE-Cadherin, oben rechts) und das Blut Glykoprotein von-Willebrand-Faktor (vWF, unten rechts) . Entsprechende Tafeln mit DAPI-Färbung Kern werden links angezeigt. Maßstabsleiste 50 um. für CD144. Bitte klicken Sie hier ein, um zu vergrößernVersion dieser Figur.

Discussion

We present a detailed protocol that allows for the robust and efficient derivation of BOECs from adult peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs). Our protocol includes two important refinements that represent advances on previous methods of BOEC isolation.^14-16 These include the absence of heparin in the initial PBMNC culture medium and the use of defined, embryonic stem cell-qualified serum. This latter refinement is of particular importance. Embryonic stem cell (ESC)-qualified serum is a more consistent grade of serum and, although it is not known yet what component(s) are enriched in the serum that benefit BOEC isolation, the impact of this defined serum on the efficiency of BOEC generation is clear in our hands. In addition, we have also had success in isolating BOECs using human serum, thereby allowing for the generation of BOECs for clinical translation. In our hands, this refined protocol results in the successful isolation of stable BOEC cultures from greater than 90% of donors, making it one of the most reliable BOEC generation methods reported thus far. Although the use of particular sera is critical to BOEC generation, it also represents a primary limitation of the current protocol. Future improvements to the technique could include the generation of these cells in serum-free, defined culture conditions.

Critical Steps in the protocol include processing blood samples as soon as possible after collection, complete harvesting of the buffy coat cells after density gradient centrifugation and the timely passaging of initial colonies from P0 to P1. This passaging step is critical to establishment of a stable isolation. Like other endothelial cells, BOECs appear to be very sensitive to plating density. If the plating density after passaging is too low, the BOECs will not proliferate. Conversely, if the colonies are allowed to become overconfluent before passaging, the cells will also cease to proliferate and have the tendency to convert into an elongated, mesenchymal cell phenotype. If few colonies appear from days 7 to 14, or if the colonies are small in size, troubleshooting can include increasing cell density by passaging P0 colonies into a T-25 flask instead of a T-75.

Once the technique is mastered, the resultant BOECs can be used in several applications, including in vitro studies of endothelial cell biology, disease modeling and drug screening, as well as in vivo cell transplantation therapies. An important consideration for the development of any cell therapy process is to use cells that are free from pathogenic mutations. We have previously shown that BOECs isolated using our protocol possess genomes that are free from copy number variations and are thus representative of the individual from which they were collected. In addition, we have also demonstrated that the majority of BOEC-derived iPSC lines are free from copy number variations.¹³ This contrasts with previous reports of copy number variation in fibroblast-derived iPSCs. To date, these cells remain the only iPSCs for which this degree of genomic fidelity has been reported. This feature is important for the field of iPSC biology and the use of iPSCs in disease modeling, drug screening and future cell transplantation therapies.

Materials

For blood collection
60 mL syringe with luer-lok tip	BD	309653
19G Surflo Winged Infusion Set	Terumo	SV-19BL
50 mL conical centrifuge tube	StarLab	E1450	2 per donor
Sodium Citrate	Martindale Pharmaceuticals	270541
Name	Company	Catalog Number	Comments
For buffy coat isolation
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03
Dulbecco’s PBS (without Ca2+ and Mg2+)	Sigma-Aldrich	D8537
Sterile wrapped plastic transfer pipettes	Appleton Woods	KC231
Turk’s Solution	Millipore	1.093E+09
Name	Company	Catalog Number	Comments
For cell culture, passaging and freezing cells
Type 1 Collagen (derived from rat tail)	BD Biosciences	35-4236
Dulbecco’s PBS (without Ca2+ and Mg2+)	Sigma-Aldrich	D8537
0.02M Acetic Acid	Sigma-Aldrich	A6283	prepared in reagent grade water
Endothelial Growth Medium-2MV (containing Bullet Kit, but not serum)	Lonza	CC-3202	Note: It is essential that the medium does not contain heparin.   Do not use EGM-2.
Fetal Bovine Serum (U.S.), Defined	Hyclone	SH30070
10x Trypsin EDTA	Gibco	T4174	Dilute to 1x in PBS prior to use
Heat Inactivated FBS	Gibco	10500-064
DMEM	Gibco	41965-039
DMSO	Sigma-Aldrich	276855
Nalgene Mr. Frosty Freezing Container	Sigma-Aldrich	C1562
Name	Company	Catalog Number	Comments
For flow cytometric characterization
FITC-conjugated mouse anti-human CD14	BD Biosciences	555397	Mouse IgG1k, Clone: WM59 Dilution: 1:20
FITC-conjugated mouse anti-human CD31	BD Biosciences	555445	Mouse IgG1k, Clone: WM59 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse anti-human CD34	BD Biosciences	555824	Mouse IgG1k, Clone: 581/CD34 Dilution: 1:20
FITC-conjugated mouse anti-human CD45	BD Biosciences	560976	Mouse IgG1k, Clone: HI30 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse anti-human VEGFR2	R&D Systems	FAB357A	Mouse IgG1, Clone: 89106 Dilution: 1:10
FITC-conjugated mouse IgG1k isotype control	BD Biosciences	555748	Clone: MOPC-21 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse IgG1k isotype control	BD Biosciences	555751	Clone: MOPC-21 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse IgG1k isotype control	R&D Systems	IC002A Dilution: 1:10	Clone: 11711
EDTA, 0.5M solution	Sigma-Aldrich	E7889
Name	Company	Catalog Number	Comments
For immunofluorescent microscopy
Corning Costar 24-well tissue culture plate	Sigma-Aldrich	CLS3527
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
BSA	Sigma-Aldrich	A7906
Polysorbate 20	Sigma-Aldrich	P2287
Monoclonal mouse anti-human CD34 antibody	R&D Systems	MAB72271	Clone 756510, IgG1, use at 10 μg/ml
Polyclonal goat anti-human VE-cadherin (CD144)	R&D Systems	AF938	Antigen affinity- purified IgG, use at 1:300
Monoclonal rabbit anti-human Von Willebrand Factor (vWF)	Abcam	ab154193	Clone EPSISR15, use at 1:250
Donkey anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-21202	Polyclonal, 2 mg/ml, use at 1:200
Donkey anti-goat IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-11055	Polyclonal, 2 mg/ml, 1:200
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate	Life Technologies	A-10042	Polyclonal,  2 mg/ml, 1:200
DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma-Aldrich	D9542	use at 1 μg/ml