Generazione e Cultura Sangue escrescenza endoteliali cellule da sangue periferico umano

Summary

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

Abstract

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

Introduction

Fino a poco tempo, la generazione post-natale di nuovi vasi sanguigni è creduto avvenire esclusivamente attraverso un processo noto come angiogenesi, definito come il germogliare di nuovi vasi dalle cellule endoteliali dei vasi preesistenti. ¹ Questo processo contrasta dalla vasculogenesi, o la formazione de novo di vasi sanguigni da progenitori endoteliali, che è stato pensato per manifesta esclusivamente durante l'embriogenesi. ^{2 Tuttavia,} studi più recenti hanno identificato e isolato cellule progenitrici endoteliali circolanti (EPC) nel sangue periferico di adulti. Queste cellule possiedono la capacità di differenziarsi in cellule endoteliali mature di cultura e si ritiene che partecipare a vasculogenesi postnatale. ^3,4

Protocolli per l'isolamento e l'espansione di queste EPC tipicamente coinvolgono la coltura di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMNCs) in supporti contenenti fattori di crescita endoteliali, tra cui vascular fattore di crescita endoteliale (VEGF) e le culture di crescita dei fibroblasti fattore-2. ^5-8 EPC produrre una varietà di tipi di cellule drammaticamente diversi. Culture iniziali (<7 giorni) sono dominati da un tipo di cellula monocitica, noto in letteratura come "early" EPC. Nonostante il loro nome, queste cellule esprimono il CD14 marcatore monociti, sono negativi per il CD34 marcatore progenitore ed esprimono livelli solo minimi della classica endoteliale marcatori CD31 e VEGF recettore 2 (VEGFR2). ⁵ coltura continua dà luogo ad una popolazione secondaria di cellule, noto come EPC fine escrescenza o cellule endoteliali escrescenza del sangue (BOECs), che appaiono come colonie discreti di cellule endoteliali-like. A differenza dei primi monocitiche EPC, BOECs, che sono stati anche chiamati formanti colonie cellule endoteliali (ECFCs), cellule endoteliali escrescenza o cellule endoteliali tardo-escrescenza, presentano la morfologia ciottoli che è tipica di monostrati cellule endoteliali e sono molto simili a marcatore di superficie5 e l'espressione genica ⁹ a maturare cellule endoteliali.

La generazione di cellule endoteliali-simili da sangue periferico offre numerosi vantaggi, in particolare per lo studio della disfunzione delle cellule endoteliali associata a disturbi vascolari quali ipertensione arteriosa polmonare (PAH) ¹⁰ o malattia di von Willebrand. ¹¹ Prima della disponibilità di BOECs, endoteliale cellule potrebbero essere derivate solo da organi espiantati al momento della morte o trapianto di organi, o isolate dalla vena ombelicale al momento della nascita. Questa ridotta disponibilità rappresentato una seria limitazione alla comprensione della biologia delle cellule endoteliali di pazienti con disturbi cardiovascolari, nonché le interazioni tra cellule endoteliali e sia cellule del sangue o cellule murali. Inoltre, isolando e coltivando una popolazione pura di cellule endoteliali da queste fonti è tecnicamente difficile e le cellule derivate da questi metodi presentano solo un limited capacità proliferativa. BOECs quindi offrire un surrogato valido per l'isolamento e la coltura di cellule endoteliali primarie derivate paziente.

Oltre alle loro applicazioni in vitro, BOECs sono anche potenzialmente utili in autologhe terapie di trapianto cellulare. Queste applicazioni comprendono sia il trapianto di cellule endoteliali di promuovere la neovascolarizzazione (vedi ¹² e riferimenti ivi), nonché la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs). ¹³ iPSCs BOEC derivati ​​possono essere utilizzate per modellare la malattia e offrono un potenziale immenso come partenza materiale per terapie cellulari autologhe. BOECs riprogrammare più velocemente e con un rendimento superiore fibroblasti cutanei. Inoltre, BOECs permettono anche per la generazione di iPSCs che siano privi di anomalie del cariotipo, che è una caratteristica essenziale di qualsiasi tecnologia che sarà adatto per applicazioni traslazionali. La capacità di generare iPSCs da un campione di sangue del paziente unaLSO elimina la necessità di una biopsia cutanea e la generazione di fibroblasti cutanei, facilitando in tal modo la generazione di cellule da pazienti con disturbi guarigione delle ferite, o molto giovane.

Il protocollo di seguito dettagliato, approvato e condotto in conformità con le linee guida del Comitato Research Service Etico Nazionale (Est Inghilterra), fornisce un metodo semplice e affidabile per la generazione di BOECs con efficienza superiore al 90% da un volume relativamente piccolo (60 ml) di sangue periferico. Queste cellule sono altamente proliferative e possono essere diversi passaggi più volte, permettendo la generazione di centinaia di milioni di cellule da un singolo campione di sangue.

Protocol

Uno schema del protocollo BOEC generazione è mostrato in Figura 1. 1. Raccolta di sangue e di densità centrifugazione in gradiente Per ciascun donatore, aggiungere 3 ml di citrato di sodio in ciascuna delle due provette da centrifuga 50 ml coniche. Raccogliere 60 ml di sangue per via venosa e aggiungere 30 ml di ogni provetta. Capovolgere delicatamente 2-3 volte per mescolare. Utilizzare non più di 40 ml di sangue nel protocollo, con volumi di citrato adeguati di conseguenza. NOTA: E 'essenziale che i campioni di sangue sono trattati entro 2 ore di raccolta. Ritardata elaborazione dei risultati del sangue in una marcata riduzione della resa colonia escrescenza. Preparare le provette coniche nuove contenenti gradiente di densità media centrifugazione dal primo capovolgendo il flacone diverse volte per mescolare. In una cappa sterile, aggiungere 15 ml di gradiente di densità media centrifugazione per tubo da 50 ml (1 provetta per ogni 10 ml di sangue, 6 tubi per donatore). Diluire il sangue 1: 1 con il fosfato di Dulbecco-Buffered Saline (DPBS). Inclinare il tubo contenente il mezzo di centrifugazione in gradiente di densità per un angolo di 20 ° con il piano di lavoro. Usando una pipetta aiuti e 25 ml pipetta sierologica, strato lentamente 21 ml di sangue diluito sopra del mezzo aggiungendo gradualmente sangue lungo la parete del tubo inclinato. NOTA: Ciò minimizzerà miscelazione del sangue con lo strato gradiente di densità e produrrà un buffy coat stretto, nonché un rendimento migliorato. Centrifugare i campioni a 400 xg per 35 minuti a temperatura ambiente con l'acceleratore e il freno. Durante questo periodo la centrifugazione, iniziare il rivestimento collagene dettagliato nei passi 2.1 – 2.4. Assicurarsi che questi passaggi sono stati completati prima di procedere al punto 3.1. 2. Il collagene Rivestimento di T-75 Flask e preparazione del terreno di coltura NOTA: Eseguire le seguenti operazioni in una cappa di coltura cellulare. Preparare una soluzione di collagene / ml 50 mg diluendo magazzino TyPe I collagene in 10 ml di acido acetico 0.02M. Esempio: per il collagene magazzino ad una concentrazione di 4,05 mg / ml, aggiungere 123,5 ml di collagene per 10 ml di acido acetico 0,02 M. Sospensione collagene filtro sterile prima dell'uso. Usando una pipetta sierologica, aggiungere 7,5 ml di soluzione di collagene in un pallone T-75 coltura cellulare. Questo volume dà 5 mg collagene / cm 2 (o 375 mg / beuta). Coat pallone per 1 ora a RT. Preparare il terreno di crescita endoteliale utilizzato per la generazione BOEC completandola medio basale endoteliale con il fattore di crescita integrazioni fornite dal produttore. Aggiungere tutti gli integratori, ma non aggiungere siero. Per preparare 15 ml di terreno BOEC generazione, aggiungere 2,5 ml di siero bovino fetale definita (FBS) a 12,5 ml di terreno di crescita endoteliale contenente il fattore di crescita supplementi. Procedere con la procedura descritta nella sezione 3. Dopo il periodo di rivestimento 1 ora, aspirare la soluzione di collagene e acido acetico lavare via residuale pipettandoin 10 ml DPBS. Aspirare fuori DPBS e ripetere l'operazione di lavaggio ancora una volta. Se la sospensione cellulare ottenuta durante la fase 3.3 non è pronto per la placcatura in questo momento, aggiungere 5 ml di mezzo BOEC generazione al pallone per mantenere il rivestimento collagene da essiccazione-out. 3. Raccolta e placcatura di PBMNCs Dopo la centrifugazione in gradiente di densità descritto al punto 1.4, raccogliere con cura lo strato buffy coat con una pipetta di trasferimento sterile in plastica. Raccolta di buffy coat dovrebbe produrre circa 20 ml di sospensione cellulare e plasma da ciascuna provetta. Evitare di trasferire il mezzo gradiente di densità. Diluire la sospensione di cellule mononucleate 1: 1 in DPBS e miscelare. Centrifugare a temperatura ambiente per 20 min a 300 xg con freno e dell'acceleratore al massimo. Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e risospendere le cellule aggiungendo 1 ml di terreno BOEC generazione in ogni pellet e pipettando su e giù ripetutamente. Cella Pool sospensioni und rabboccare volume totale di 10 ml con il mezzo rimanente. Per ottenere una stima del numero totale delle cellule, campione 10 ml di sospensione cellulare e diluire 50x con 490 ml di soluzione Turk, che la lisi dei globuli rossi. Contare un campione di 10 microlitri di sospensione cellulare diluita utilizzando un emocitometro. NOTA: 60 ml di sangue dovrebbe produrre circa 100-150 x 10 6 cellule bianche del sangue per la placcatura. Piastra sospensione intera cella in un unico, collagene rivestite T-75 pallone, rabboccare il volume medio 15mL / beuta e coltura a 37 ° C in atmosfera umidificata contenente il 5% di CO 2. Le cellule placcati in questo momento rappresentano il passaggio 0. NOTA: È possibile congelare le PBMNCs isolate prima dell'isolamento BOEC per derivare le BOECs in un secondo tempo o per trasportare i PBMNCs ad un laboratorio diverso in cui possono essere generati i BOECs. Tuttavia, è importante notare che PBMNCs congelamento potrebbero ridurre l'efficienza di isolamento BOEC. SSezione 8 ee sotto per il metodo. Colture cellulari 4. A lungo termine Cambiare media ogni 2 giorni con l'aggiunta di 15 ml di mezzo fresco generazione BOEC (5: 1 miscela di cellule endoteliali mezzo di crescita e definito FBS). Per il fine settimana, i cambiamenti medi possono essere ritardate per ogni 3 giorni. NOTA: le colonie conseguenza dovrebbe apparire tra 7 e 14 giorni di coltura. Monitorare il pallone di coltura BOEC nei giorni 7-14 per la comparsa di colonie escrescenza. Identificare le colonie come gruppi circolari di cellule che presentano un classico ciottoli morfologia endoteliale. Una volta che una colonia o più colonie sono identificate nel pallone, continuare con i cambiamenti medi e permettono colonie di crescere a circa 1000 a 2000 cellule per colonia prima passaging. Determinare il numero di cellule per colonia attraverso una stima visiva approssimativa. NOTA: Come guida, si è soliti passaggio colonie escrescenza iniziali Una settimana dopo l'identificazione della prima colonia conseguenza. <li> cellule Passage di risciacquo fiaschi due volte con 10 ml di DPBS. Aggiungere 5 ml di 1X tripsina-EDTA e incubare in un incubatore a 37 ° per 5 minuti. Dopo 5 minuti, neutralizzare tripsina con 10 ml di terreno (contenente FBS) e portare le cellule in sospensione con pipettaggio ripetuto. Sospensione Centrifugare a 300 xg per 5 min, risospendere in 15 ml di mezzo fresco generazione BOEC e piastra intera sospensione cellulare in un pallone nuovo T-75 (che rappresenta il passaggio 1, P1). Non è richiesto alcun rivestimento collagene. Continuare cambiamenti terreno come descritto sopra finché le cellule sono confluenti (circa 3-5 x 10 6 cellule per pallone). Una volta confluenti, cellule di passaggio come descritto al punto 4.3. NOTA: Dal passaggio 2 in poi, le cellule richiedono non più di media BOEC generazione e può essere coltivato in endoteliali terreno di crescita cellulare e il 10% di serie FBS inattivato al calore. Rivestimento Il collagene può essere usato come un passo opzionale andando avanti, in quanto non vi sono prove che suggeriscono che la presenza di collagene può migliorare prolifer BOECtassi ation. Per preservare le passaging, piatto non meno di 750.000 cellule per T-75 pallone come la densità di cellule basse possono causare i BOECs per fermare la proliferazione. 5. Congelamento e culture scongelamento BOEC Trypsinize cellule come descritto nella sezione 4.3 e centrifugare a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante e risospendere in 10 ml di terreno. Ciò non richiede endoteliale terreno di crescita cellulare; DMEM con 10% FBS standard, sarà sufficiente. Raccogliere un campione di 10 microlitri di sospensione cellulare per eseguire un numero di cellule utilizzando un emocitometro manuale. Ancora centrifuga e risospendere a 2×10 6 cellule / ml in mezzo di crioconservazione ghiacciata (40% DMEM con il 50% FBS e il 10% DMSO). Aggiungere 0,5 ml (10 6 celle) per ogni fiala, posto fiale in un ghiaccio isopropanolo freddo nave crioconservazione e posto in una -80 ° C freezer per almeno 2 ore prima del trasferimento di azoto liquido. Non lasciare celle a -80 ° C per più di 24 ore. </li> Per scongelare le cellule, aggiungere 10 ml di terreno pre-riscaldato a un 15 ml provetta da centrifuga conica. NOTA: Per scongelare fuori passaggio 1 cellule, scongelare in endoteliali terreno di coltura cellulare integrato con il 20% FBS definito per i primi 2 giorni dopo lo scongelamento. Questo porta ad un isolamento delle cellule più stabile per il futuro. Rimuovere le cellule di azoto liquido e disgelo in un bagno d'acqua a 37 ° con agitazione fino a quando solo un piccolo cristallo di ghiaccio è rimasto nel flaconcino. Aggiungere il contenuto della fiala goccia a goccia nella provetta da centrifuga conica e centrifugare a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante e risospendere pellet cellulare in 10 ml EGM-2MV + 10% FBS. Aggiungi a pallone T-75 e rabboccare medio a 15 ml. 6. Caratterizzazione di BOECs mediante citometria di flusso Una volta che le colonie BOEC cui alla Sezione 4 sono stati autorizzati a espandersi, trypsinize cellule come descritto nel paragrafo 4.4 e risospendere ad una concentrazione di 10 6 cellule per ml in tampone colorazione (DPBS ingegnoh 2% FBS e 2 mM EDTA). Combina 10 5 cellule con anticorpi coniugati a fluorocromi diretti contro CD45, CD14, CD34, CD31 (uso tutto a 1:20 diluizione) o VEGFR2 (diluito 1:10) (vedi Tabella 1 per i dettagli). Incubare per 30 minuti a 4 ° C al buio. Lavare le cellule con 1 ml di tampone di colorazione e centrifugare a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante e risospendere in 400 microlitri di buffer di colorazione per l'analisi. Mantenere cellule a 4 ° C e al riparo dalla luce prima dell'analisi. Eseguire l'analisi di citometria su un citometro attrezzato per rilevare gli anticorpi coniugati fluorescenza utilizzati nel test. Utilizzare un campione BOEC macchia per identificare la popolazione di cellule sul citometro regolando avanti e tensioni scatter laterale, così come le tensioni per i canali FITC e APC. Determinare gating soglie utilizzando cellule isotipo colorate per ogni fluorocromo. Valutare positività per ogni marcatore superficie cellulare basato sulla Presence di uno spostamento picco dell'intensità di fluorescenza contro controllo isotipo per il fluorocromo analizzato. 7. Caratterizzazione di BOECs da immunofluorescente Microscopia BOECs piatto in un pozzo 24, a fondo piatto piastra di coltura tissutale senza vetrini in una densità di 5 x 10 4 cellule in 500 ml di endoteliale terreno di crescita delle cellule + 10%-inattivato con il calore FBS per bene e lasciare ad aderire e crescere a 37 ° C, 5% CO 2 fino cellule coprire almeno il 70-80% della superficie di ciascun pozzetto (stima confluenza mediante ispezione visiva sotto una microsope luce). Lavare le cellule in ciascun pozzetto per 5 min con 1 ml di DPBS. Fissare cellule O / N a 4 ° C con 500 ml di soluzione di paraformaldeide 4% in DPBS. Lavare le cellule per 3 x 5 min con 1 ml di DPBS per pozzetto. Aggiungere e rimuovere i DPBS utilizzando una pipetta e un aspiratore, rispettivamente. Permeabilize cellule da 3 x 10 minuti con 0,2% polisorbato 20 in DPBS. </li> Incubare le cellule per 1 ora a RT in tampone di bloccaggio contenente 10% FBS in DPBS. Cellule Stain a 4 ° CO / N in 300 ml di tampone di diluizione anticorpo (0,1% di albumina di siero bovino in DPBS) contenente anticorpi primari diretti contro CD34 (10 mcg / ml), CD144 (1: 300) o vWF (1: 250) . Vedere la Tabella 1 per tutti i dettagli. Lavare gli anticorpi primari non legati per 5 x 10 min con DPBS. Incubare le cellule per 1 ora a RT con l'anticorpo secondario fluorescenza marcata appropriata, come indicato nella tabella 1 (tutto a 1: 200). Lavare anticorpi secondari non legati per 5 x 10 min con DPBS. Incubare le cellule con 1 mg / ml 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) in DPBS per 10 minuti a RT. Lavare le cellule con DPBS per ulteriori 3 x 5 min. Celle di immagine di ingrandimento 100x utilizzando un microscopio invertito dotato di una sorgente di luce esterna per l'eccitazione di fluorescenza, e catturare immagini con un allegarefotocamera digitale cato per la successiva analisi offline. 8. gelo e disgelo PBMNCs Al termine della fase 3.2, dopo centrifugazione, aspirare il terreno e interrompere manualmente il pellet cellulare con pipettando ripetutamente su e giù con una punta della pipetta P1000. Aggiungere 1 ml di mezzo di congelamento, siero 90% e il 10% DMSO, avendo cura di mescolare delicatamente per ottenere una sospensione di cellule. Trasferire la sospensione cellulare per un esageratamente e congelare e scongelare come descritto nella Sezione 5.

Representative Results

Isolamento di buffy cellule mononucleate cappotto da 60 ml di sangue produce tipicamente 100-150×10 6 totali globuli bianchi. Quando placcato in un'unica T-75 pallone, il gran numero di cellule in sospensione cellulare non lisati rende difficile risolvere singole cellule aderenti mediante microscopia in campo chiaro. Cambiamenti medi ripetute provocano il passaggio di cellule non aderenti e consentono la visualizzazione della popolazione aderente monocitica "primi" EPC. Al giorno 7, il T-75 conterrà circa 7×10 6 di queste cellule aderenti allungate. Dal giorno 7-14, colonie di BOECs dovrebbero apparire all'interno del pallone (Figura 2A). Colonies prima appaiono come 3 a 5 celle adiacenti. Numero colonia conseguenza può variare da 1 a 10 colonie per 60 ml di sangue. Generalmente, i donatori più giovani (cioè, 20-25 anni) tendono a produrre un maggior numero di colonie escrescenza, che appaiono anche in precedenza in coltura.BOECs proliferano da questo gruppo centrale di cellule di formare colonie circolari composti da diverse centinaia di cellule. Cellule all'interno di queste colonie presentano un classico ciottoli morfologia endoteliale. È preferibile passaggio colonie iniziali quando contengono circa 1000 cellule per colonia. Colonie escrescenza tipicamente raggiungono queste dimensioni 7 giorni dopo il loro aspetto originario nella cultura. Una volta che le colonie originali sono diversi passaggi in un pallone nuovo T-75, dovrebbero proliferare di formare un monostrato confluente (3-5×10 6 cellule per pallone) entro 5 giorni o meno (Figura 2B). In una piccola percentuale di isolamenti (<10%), le colonie escrescenza non si presentano, o non proliferano sufficientemente seguendo questo primo passo passaging. BOECs che presentano bassa proliferazione dopo il loro primo passaging raramente vanno a diventare isolamenti BOEC stabili e spesso smettere di proliferare entro due o tre passaggi. Il monociticaprimi EPC contenuti all'interno delle culture BOEC sono non proliferativa e sono tipicamente cancellati dalle culture in 1-2 passaggi. Liquidazione di questi primi cellule è dovuta alla morte cellulare, il fallimento dei primi cellule di ri-aderire dopo passaging e diluizione dei non proliferative primi EPC con passaging ripetuto. Passage celle 1 possono sia essere diversi passaggi ulteriormente nella cultura o congelati giù per un uso successivo. Una volta generato un isolamento stabile, le cellule possono essere diversi passaggi ad una velocità di 1 boccetta confluenti a 3-5 nuovi T-75 beute fino passaggio 8 o 9 prima di diventare quiescente. Anche in questo caso, la densità delle cellule è fondamentale per tutta la cultura. Nella nostra esperienza, non meno di 750.000 cellule devono essere placcato in un pallone T-75, come la densità di cellule più bassi possono causare arresto della crescita. Nonostante l'elevato potenziale proliferativo di BOECs, cellule devono anche non essere permesso di diventare overconfluent (es.,> 5×10 6 cellule per pallone) e questo può causare Convers ioni di BOECs ad un fenotipo non proliferativa. Proponiamo che ogni cellula di essere etichettato come un BOEC deve visualizzare superficie cellulare appropriato e colorazione intracellulare per i marcatori endoteliali. Caratterizzazione di BOECs può essere ottenuto mediante citometria di flusso (figura 3) o microscopia a fluorescenza (Figura 4), ​​dopo colorazione per marcatori tipici delle cellule endoteliali. BOECs sono positivi per il CD31 marcatori di superficie endoteliale e VEGFR2 e sono negativi per il CD14 marcatore monociti e il pan-leucociti marcatore CD45. BOECs hai tutti anche i corpi di Weibel-Palade e quindi esprimere von Willebrand (vWF) come discreta, puntata colorazione citoplasmatica. A differenza di altri tipi di cellule endoteliali mature, come arteria polmonare o cellule endoteliali aortiche, BOECs esprimono anche il progenitore e l'attivazione marcatore CD34 sulla loro superficie. ftp_upload / 53384 / 53384fig1.jpg "/> Figura 1. Schema di protocollo BOEC generazione. Cellule mononucleate del sangue periferico sono isolati dal sangue venoso dal gradiente di densità centrifugazione e coltivate su piastre di collagene rivestite con terreno di crescita endoteliale contenenti definiti FBS. Colonie BOEC compaiono entro 7-14 giorni di coltura. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 2. Immagini Brightfield di culture BOEC rappresentativi. (A) colonie escrescenza appaiono in culture tra i giorni 7 e 14. Le colonie presenti collezioni di cellule endoteliali-simili, che sono disposti in un monostrato di ciottoli e proliferano radialmente fuori da un punto centrale. Intorno le colonie escrescenza sono mono aderenticellule cytic che costituiscono la stragrande maggioranza delle cellule nelle colture precoci. Queste cellule, precedentemente descritte come "presto" le cellule progenitrici endoteliali, hanno una morfologia fuso-like e esprimono il marcatore CD14 monocitiche. (B) A seguito passaging, i BOECs altamente proliferative prendere in consegna le culture, come le cellule monocitiche non proliferative o muoiono o non riescono a riattaccare dopo passaging. Scala bar 250μm. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 3. Caratterizzazione di BOECs mediante citometria di flusso. BOECs stati tripsinizzate e colorati con gli anticorpi di controllo isotipo fluorescente-coniugati (gray picco pieno) o anticorpi diretti contro marcatori di superficie specifici (linea rossa). Marcatori di superficie per la caratterizzazione di citometriaincludono i marcatori ematopoietici CD45 e CD14, i marcatori endoteliali CD31 e VEGFR2 e la progentior e marcatore endoteliale CD34. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 4. immunofluorescenza di BOECs per i marcatori delle cellule endoteliali. Immunofluorescenza immagini rappresentative dei BOECs immunostained con anticorpi diretti contro endoteliali marcatore CD144 superficie cellulare (VE-caderina, pannello superiore a destra) e la glicoproteina sangue Fattore di von Willebrand (vWF, in basso pannello di destra) . Pannelli corrispondenti mostrano colorazione DAPI nucleare sono mostrati a sinistra. Scala della barra 50 micron. per CD144. Cliccate qui per vedere una più grandeversione di questa figura.

Discussion

We present a detailed protocol that allows for the robust and efficient derivation of BOECs from adult peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs). Our protocol includes two important refinements that represent advances on previous methods of BOEC isolation.^14-16 These include the absence of heparin in the initial PBMNC culture medium and the use of defined, embryonic stem cell-qualified serum. This latter refinement is of particular importance. Embryonic stem cell (ESC)-qualified serum is a more consistent grade of serum and, although it is not known yet what component(s) are enriched in the serum that benefit BOEC isolation, the impact of this defined serum on the efficiency of BOEC generation is clear in our hands. In addition, we have also had success in isolating BOECs using human serum, thereby allowing for the generation of BOECs for clinical translation. In our hands, this refined protocol results in the successful isolation of stable BOEC cultures from greater than 90% of donors, making it one of the most reliable BOEC generation methods reported thus far. Although the use of particular sera is critical to BOEC generation, it also represents a primary limitation of the current protocol. Future improvements to the technique could include the generation of these cells in serum-free, defined culture conditions.

Critical Steps in the protocol include processing blood samples as soon as possible after collection, complete harvesting of the buffy coat cells after density gradient centrifugation and the timely passaging of initial colonies from P0 to P1. This passaging step is critical to establishment of a stable isolation. Like other endothelial cells, BOECs appear to be very sensitive to plating density. If the plating density after passaging is too low, the BOECs will not proliferate. Conversely, if the colonies are allowed to become overconfluent before passaging, the cells will also cease to proliferate and have the tendency to convert into an elongated, mesenchymal cell phenotype. If few colonies appear from days 7 to 14, or if the colonies are small in size, troubleshooting can include increasing cell density by passaging P0 colonies into a T-25 flask instead of a T-75.

Once the technique is mastered, the resultant BOECs can be used in several applications, including in vitro studies of endothelial cell biology, disease modeling and drug screening, as well as in vivo cell transplantation therapies. An important consideration for the development of any cell therapy process is to use cells that are free from pathogenic mutations. We have previously shown that BOECs isolated using our protocol possess genomes that are free from copy number variations and are thus representative of the individual from which they were collected. In addition, we have also demonstrated that the majority of BOEC-derived iPSC lines are free from copy number variations.¹³ This contrasts with previous reports of copy number variation in fibroblast-derived iPSCs. To date, these cells remain the only iPSCs for which this degree of genomic fidelity has been reported. This feature is important for the field of iPSC biology and the use of iPSCs in disease modeling, drug screening and future cell transplantation therapies.

Materials

For blood collection
60 mL syringe with luer-lok tip	BD	309653
19G Surflo Winged Infusion Set	Terumo	SV-19BL
50 mL conical centrifuge tube	StarLab	E1450	2 per donor
Sodium Citrate	Martindale Pharmaceuticals	270541
Name	Company	Catalog Number	Comments
For buffy coat isolation
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03
Dulbecco’s PBS (without Ca2+ and Mg2+)	Sigma-Aldrich	D8537
Sterile wrapped plastic transfer pipettes	Appleton Woods	KC231
Turk’s Solution	Millipore	1.093E+09
Name	Company	Catalog Number	Comments
For cell culture, passaging and freezing cells
Type 1 Collagen (derived from rat tail)	BD Biosciences	35-4236
Dulbecco’s PBS (without Ca2+ and Mg2+)	Sigma-Aldrich	D8537
0.02M Acetic Acid	Sigma-Aldrich	A6283	prepared in reagent grade water
Endothelial Growth Medium-2MV (containing Bullet Kit, but not serum)	Lonza	CC-3202	Note: It is essential that the medium does not contain heparin.   Do not use EGM-2.
Fetal Bovine Serum (U.S.), Defined	Hyclone	SH30070
10x Trypsin EDTA	Gibco	T4174	Dilute to 1x in PBS prior to use
Heat Inactivated FBS	Gibco	10500-064
DMEM	Gibco	41965-039
DMSO	Sigma-Aldrich	276855
Nalgene Mr. Frosty Freezing Container	Sigma-Aldrich	C1562
Name	Company	Catalog Number	Comments
For flow cytometric characterization
FITC-conjugated mouse anti-human CD14	BD Biosciences	555397	Mouse IgG1k, Clone: WM59 Dilution: 1:20
FITC-conjugated mouse anti-human CD31	BD Biosciences	555445	Mouse IgG1k, Clone: WM59 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse anti-human CD34	BD Biosciences	555824	Mouse IgG1k, Clone: 581/CD34 Dilution: 1:20
FITC-conjugated mouse anti-human CD45	BD Biosciences	560976	Mouse IgG1k, Clone: HI30 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse anti-human VEGFR2	R&D Systems	FAB357A	Mouse IgG1, Clone: 89106 Dilution: 1:10
FITC-conjugated mouse IgG1k isotype control	BD Biosciences	555748	Clone: MOPC-21 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse IgG1k isotype control	BD Biosciences	555751	Clone: MOPC-21 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse IgG1k isotype control	R&D Systems	IC002A Dilution: 1:10	Clone: 11711
EDTA, 0.5M solution	Sigma-Aldrich	E7889
Name	Company	Catalog Number	Comments
For immunofluorescent microscopy
Corning Costar 24-well tissue culture plate	Sigma-Aldrich	CLS3527
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
BSA	Sigma-Aldrich	A7906
Polysorbate 20	Sigma-Aldrich	P2287
Monoclonal mouse anti-human CD34 antibody	R&D Systems	MAB72271	Clone 756510, IgG1, use at 10 μg/ml
Polyclonal goat anti-human VE-cadherin (CD144)	R&D Systems	AF938	Antigen affinity- purified IgG, use at 1:300
Monoclonal rabbit anti-human Von Willebrand Factor (vWF)	Abcam	ab154193	Clone EPSISR15, use at 1:250
Donkey anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-21202	Polyclonal, 2 mg/ml, use at 1:200
Donkey anti-goat IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-11055	Polyclonal, 2 mg/ml, 1:200
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate	Life Technologies	A-10042	Polyclonal,  2 mg/ml, 1:200
DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma-Aldrich	D9542	use at 1 μg/ml