Geração e cultura de sangue Conseqüência células endoteliais do sangue periférico humano

Summary

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

Abstract

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

Introduction

Até recentemente, acreditava a geração pós-natal de novos vasos sanguíneos a ocorrer exclusivamente através de um processo conhecido como angiogênese, definida como o surgimento de novos vasos a partir das células endoteliais dos vasos pré-existentes. ¹ Este processo contrasta da vasculogênese, ou a formação de novo de vasos sanguíneos a partir de células progenitoras endoteliais, o que foi pensado para ocorrer exclusivamente durante a embriogénese. ² No entanto, estudos mais recentes foram identificados e isolados circulantes células progenitoras endoteliais (CPE) no sangue periférico de adultos. Estas células possuem a capacidade de se diferenciarem em células endoteliais maduras em cultura e são acreditados para participar na vasculogénese pós-natal. ^3,4

Os protocolos para o isolamento e expansão destas EPCs envolvem tipicamente a cultura de células mononucleares de sangue periférico (PBMNCs) em meio contendo factores de crescimento endoteliais, incluindo Vasculfactor de crescimento endotelial AR (VEGF) e factor de crescimento de fibroblastos-2. ^5-8 culturas EPC produzir uma variedade de tipos de células diferentes dramaticamente. Culturas iniciais (<7 dias) são dominadas por um tipo de célula monocítica, conhecido na literatura como "precoces" EPCs. Apesar do seu nome, estas células expressam o CD14 marcador de monócitos, são negativas para CD34 marcador de células progenitoras e expressar apenas níveis mínimos dos marcadores CD31 endotelial clássica e VEGF receptor 2 (VEGFR2). ⁵ cultura contínua dá origem a uma população secundária de células, conhecido como EPCs final excrescência ou células endoteliais conseqüência sangue (BOECs), que aparecem como colónias discretas de células endoteliais-like. Ao contrário das primeiras EPCs monocíticas, BOECs, que também tem sido chamado de formação de colónias de células endoteliais (ECFCs), células endoteliais ou células endoteliais excrescência de fim de crescimento, exibem a morfologia paralelepípedos que é típico de monocamadas de células endoteliais e são altamente semelhantes em marcador de superfície5 e ^9, a expressão do gene para amadurecer as células endoteliais.

A geração de células endoteliais semelhantes a partir de sangue periférico oferece várias vantagens, particularmente para o estudo da disfunção das células endoteliais associadas com desordens vasculares, tais como hipertensão arterial pulmonar (HAP) ¹⁰ ou de von Willebrand doença. ¹¹ Antes da disponibilidade de BOECs, endotelial células só pode ser derivada a partir de órgãos explantados no momento da morte ou transplante de órgãos, ou isolado a partir da veia umbilical ao nascimento. Esta disponibilidade reduzida representada uma limitação séria para a compreensão da biologia das células endoteliais a partir de pacientes com doenças cardiovasculares, assim como as interacções entre as células endoteliais e as células do sangue ou quer células murais. Além disso, o isolamento e a cultura de uma população pura de células endoteliais a partir destas fontes é tecnicamente exigente e as células obtidas por estes métodos apresentam apenas uma LIMITEd capacidade proliferativa. BOECs portanto oferecer um substituto valioso para o isolamento e cultura de células endoteliais primárias derivadas do paciente.

Para além das suas aplicações in vitro, BOECs também são potencialmente úteis em terapias de transplante de células autólogas. Estas aplicações incluem tanto o transplante de células endoteliais para promover neovascularização (ver ¹² e referências ai), bem como a geração de células estaminais pluripotentes induzidas (iPSCs). ¹³ iPSCs BOEC-derivados pode ser usada para modelar doenças e oferecer imenso potencial como o ponto de partida material para terapias com células autólogas. BOECs reprogramar mais rápido e com uma maior eficiência do que os fibroblastos da pele. Além disso, também permitem que BOECs para a geração de iPSCs que estão livres de anomalias karyotypic, o que é uma característica essencial de qualquer tecnologia que será adequado para aplicações de translação. A capacidade para gerar iPSCs de uma amostra de sangue de um pacientelso elimina a necessidade de uma biópsia da pele e a geração de fibroblastos da pele, facilitando assim a geração de células de pacientes com distúrbios cicatrização de feridas, ou os muito jovens.

O protocolo detalhado abaixo, aprovado pelo e conduzida de acordo com as orientações do Comitê de Serviço de Ética em Pesquisa Nacional (leste da Inglaterra), fornece um método simples e confiável para a geração de BOECs com rendimento superior a 90% de um volume relativamente pequeno (60 ml) de sangue periférico. Estas células são altamente proliferativas e podem ser passadas várias vezes, permitindo a geração de centenas de milhões de células a partir de uma única amostra de sangue.

Protocol

Um esquema do protocolo de geração BOEC é mostrado na Figura 1. 1. Sangue Coleta e centrifugação em gradiente de densidade Para cada doador, adicionar 3 ml de citrato de sódio para cada um dos dois tubos de centrífuga de 50 mL cónicos. Recolha de 60 ml de sangue por punção venosa e adicionar 30 ml a cada tubo. Inverta suavemente 2-3 vezes para misturar. Use tão pouco quanto 40 ml de sangue no protocolo, com volumes de citrato ajustados em conformidade. NOTA: É essencial que as amostras de sangue são processados ​​dentro de 2 horas da coleta. Processamento de sangue resulta em atraso de uma redução acentuada no rendimento de crescimento de colónias. Preparar novos tubos cónicos contendo meio de centrifugação por gradiente de densidade primeiro invertendo o frasco várias vezes para misturar. Em um capuz estéril, adicione 15 ml de meio de centrifugação em gradiente de densidade por tubo de 50 ml (1 tubo para cada 10 ml de sangue, 6 tubos por doador). Dilui-se o sangue 1: 1 com fosfato de Dulbecco-Buffered Saline (DPBS). Inclinar o tubo contendo o meio de centrifugação em gradiente de densidade para um ângulo de 20 ° com a superfície de trabalho. Usando uma pipeta de ajuda e uma pipeta serológica 25 ml, camada lentamente 21 ml de sangue diluído em cima do meio por adição gradual de sangue na parede do tubo inclinado. NOTA: Se o fizer, irá minimizar a mistura do sangue com a camada de gradiente de densidade e irá produzir um revestimento mais apertado Buffy, bem como um rendimento melhorado. Centrifugar as amostras a 400 xg durante 35 min à temperatura ambiente com o acelerador e o travão de fora. Durante este período de centrifugação, iniciar o revestimento de colagénio detalhados nos passos 2.1 – 2.4. Garantir que essas etapas foram concluídas antes de prosseguir para a etapa 3.1. 2. O colágeno Revestimento de T-75 Flask e Preparação de Meio de Cultura NOTA: Execute as seguintes etapas em uma capa de cultura de células. Prepara-se uma solução de colagénio / ml 50 ug por diluição da Type colagénio I em 10 ml de 0,02 M de ácido acético. Exemplo: Para estoque de colagénio a uma concentração de 4,05 mg / ml, adicionar 123,5 mL de colagénio de 10 ml de ácido acético 0,02 M. Suspensão de colagénio Filtrar em condições estéreis antes da utilização. Usando uma pipeta serológica, adicionar 7,5 ml de solução de colagénio a um frasco de cultura de células T-75. Este volume dá 5 ug de colagénio / cm2 (ou 375 ug / balão). Revestimento balão durante 1 h à TA. Prepara-se o meio de crescimento endotelial usado para geração BOEC suplementando o meio basal endotelial com os suplementos de factor de crescimento fornecidos pelo fabricante. Adicionar todos os suplementos, mas não adicionar soro. Para preparar 15 ml de meio de geração BOEC, adicionar 2,5 ml de soro de bovino fetal definido (FBS) a 12,5 ml de meio de crescimento endotelial contendo os suplementos de factor de crescimento. Prossiga com as etapas descritas na Seção 3. Após o período de revestimento de 1 hora, aspirar a solução de colágeno e lavar o ácido acético residual por pipetagemem 10 ml de DPBS. Aspirar fora do DPBS e repita esta etapa de lavagem mais uma vez. Se a suspensão de células obtidas durante o passo 3.3 não está pronto para plaqueamento a este tempo, adicionar 5 ml de meio de geração BOEC ao frasco para manter o revestimento de colagénio à secagem. 3. Recolha e chapeamento de PBMNCs Após a centrifugação de gradiente de densidade descrito na etapa 1.4, cuidadosamente recolher a camada buffy coat usando uma pipeta de transferência de plástico estéril. Recolha de buffy coat deve produzir aproximadamente 20 ml de suspensão de células e no plasma de cada tubo. Evitar a transferência do meio de gradiente de densidade. Dilui-se a suspensão de células mononucleares de 1: 1 em DPBS e invertido para misturar. Centrifuga-se a TA durante 20 min a 300 xg, com freio e do acelerador no máximo. Após a centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células por adição de 1 ml de meio de geração BOEC a cada sedimento e pipetando para cima e para baixo várias vezes. Célula suspensões uma piscinad top-se volume total de 10 ml com o meio remanescente. Para obter uma estimativa do número total de células, a amostra 10 ul de suspensão de células e diluir com 490 50x ul de solução de Turk, que irá lisar as células vermelhas do sangue. Contagem de uma amostra de 10 uL da suspensão de células diluídas utilizando um hemocitómetro. NOTA: 60 mL de sangue deve render cerca de 100-150 x 10 6 células brancas do sangue para o chapeamento. Placa suspensão célula inteira em um único frasco T-75, revestidos com colagénio, topo-se o volume para 15 mL meio / balão e cultura a 37 ° C em atmosfera humidificada contendo um 5% de CO 2. Células plaqueadas neste momento representam passagem 0. NOTA: É possível congelar os PBMNCs isolado antes do isolamento BOEC, a fim de derivar os BOECs em um momento posterior, ou a fim de transportar os PBMNCs para um laboratório diferente onde os BOECs pode ser gerado. No entanto, é importante notar que PBMNCs congelação poderia reduzir a eficiência do isolamento BOEC. SEE secção 8 a seguir para o método. 4. Cultura de Células de longo prazo Mudança de meio a cada 2 dias, adicionando 15 ml de meio de geração BOEC fresco (mistura 5: 1 de meio de crescimento de células endoteliais e definido de FBS). Para fins de semana, as mudanças de meio pode ser retardada a cada 3 dias. NOTA: colônias conseqüência deve aparecer entre 7 e 14 dias de cultura. Monitorar a garrafa de cultura BOEC nos dias 7-14 para o aparecimento de colônias conseqüência. Identificar colônias como grupos circulares de células que exibem uma morfologia de paralelepípedos clássico endotelial. Uma vez que uma colónia ou colónias múltiplas são identificados no balão, continuar com as mudanças de meio e permitir que as colónias a crescer para aproximadamente 1000 a 2000 células por colónia antes Passaging. Determinar o número de células por colónia através de uma estimativa visual aproximada. NOTA: Como um guia, é habitual a passagem colônias conseqüência iniciais de uma semana após a identificação da primeira colônia conseqüência. <li> células da passagem por enxaguamento frascos duas vezes com 10 ml de DPBS. Adicionar 5 ml de tripsina-EDTA 1X e incubar numa incubadora a 37 ° C durante 5 min. Após 5 min, neutralizar a tripsina com 10 mL de meio (contendo FBS) e trazer as células em suspensão com pipetagem repetida. Centrifugar a suspensão a 300 xg durante 5 min, ressuspender em 15 ml de meio fresco e geração BOEC placa suspensão célula inteira para um novo frasco de T-75 (representando uma passagem, P1). Não é necessário o revestimento de colagénio. Continuar as mudanças de meio, como descrito acima até que as células estão confluentes (cerca de 3-5 x 10 6 culas por frasco). Uma vez confluentes, as células de passagem tal como descrito na etapa 4.3. NOTA: A partir de passagem 2 em diante, as células já não necessitam de forma geração BOEC e podem ser cultivadas em meio de crescimento de células endoteliais e 10% de FBS inactivado pelo padrão de calor. Revestimento de colagénio pode ser usado como um passo opcional daqui para a frente, como não há evidência que sugira que a presença de colagénio pode aumentar a prolifer BOECtaxas ation. Para passaging contínuo, placa de nada menos do que 750.000 células por balão T-75 como densidades celulares baixas podem fazer com que os BOECs para parar a proliferar. 5. Congelamento e descongelamento culturas BOEC Tripsinizar as células como descrito na secção 4.3 e centrifugar a 300 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender em 10 ml de meio. Isto não requer meio de crescimento celular endotelial; DMEM com 10% de FBS padrão será suficiente. Recolher uma amostra de 10 uL da suspensão de células para realizar uma contagem de células manual usando um hemocitómetro. Centrifugar novamente e ressuspender a 2×10 6 células / ml em meio de criopreservação em gelo (40% de DMEM com 50% de FBS e 10% de DMSO). Adicionar 0,5 ml (10 6 células) para cada frasco, frascos em um lugar isopropanol frio navio criopreservação de gelo e coloque em um freezer -80 ° C durante pelo menos 2 horas antes da transferência para nitrogênio líquido. Não deixar as células a -80 ° C durante mais de 24 horas. </li> Para descongelar células, adicionar 10 ml de meio de pré-aquecido a um tubo de centrífuga de 15 ml cônico. NOTA: Quando descongelando células passagem 1, descongelar em meio de crescimento celular endotelial suplementado com FBS a 20% definido para os primeiros 2 dias após a descongelação. Isto leva a um isolamento de células mais estável no futuro. Remover as células a partir de azoto líquido e descongelamento num banho de água a 37 C ° com agitação suave até que apenas um pequeno cristal de gelo é deixado no frasco. Adicionar o conteúdo do frasco, gota a gota ao tubo de centrífuga cónico e girar a 300 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 10 ml de EGM-2 mV + 10% de FBS. Adicionar a T-75 frasco e meio superior até 15 ml. 6. Caracterização de BOECs por citometria de fluxo Uma vez que as colônias BOEC descritos na Seção 4 foram autorizados a se expandir, Trypsinize células como descrito na secção 4.4 e ressuspender a uma concentração de 10 6 células por ml em tampão de coloração (DPBS sagacidadeh 2% de FBS e 2 mM de EDTA). Combine 10 5 células com anticorpos de fluorocromo conjugado dirigidos contra CD45, CD14, CD34, CD31 (use toda a diluição 1:20) ou VEGFR2 (diluir 1:10) (ver Tabela 1 para mais detalhes). Incubar durante 30 min a 4 ° C no escuro. Lavar as células com 1 ml de tampão e centrifuga-se a coloração a 300 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender em 400 ul de tampão de coloração para análise. Manter as células a 4 ° C e protegidas da luz antes da análise. Realizar a análise de citometria de um citómetro equipado para detectar os anticorpos conjugados fluorescentes utilizadas no ensaio. Usar uma amostra BOEC não corado para identificar a população de células no citómetro ajustando para a frente e tensões de dispersão lateral, assim como as tensões para os canais FITC e APC. Determinar gating limiares utilizando células Isótipo manchado para cada fluorocromo. Avaliar a positividade para cada marcador da superfície celular com base na presence de um deslocamento de pico na intensidade de fluorescência versus controlo do isotipo para o fluorocromo a ser analisado. 7. Caracterização de BOECs por microscopia imunofluorescente BOECs placa numa cavidades 24, do tecido placa de cultura de fundo plano, sem lamelas a uma densidade de 5 x 10 4 células em 500 ul de meio de crescimento de células endoteliais + 10% de FBS por poço e deixar a aderir e crescer a 37 inactivado por calor ° C, 5% de CO 2 até que as células cobrir, pelo menos, 70-80% da área de superfície de cada poço (estimativa de confluência por inspecção visual sob uma luz microsope). Lave as células em cada poço durante 5 minutos com 1 ml de DPBS. Fix células o / n a 4 ° C com 500 ul de solução de paraformaldeído a 4% em DPBS. Lave as células durante 3 x 5 min com 1 ml de DPBS por poço. Adicionar e remover os DPBS usando uma pipeta e um aspirador, respectivamente. Permeabilizar as células durante 3 x 10 min, com 0,2% de polissorbato 20 em DPBS. </li> Incubar as células durante 1 h à TA em tampão contendo 10% de FBS em DPBS bloqueio. Células da mancha na 4 ° CO / N em 300 ul de tampão de diluição de anticorpo (0,1% de albumina de soro bovino em DPBS) contendo anticorpos primários dirigidos contra CD34 (10 ug / ml), CD144 (1: 300) ou vWF (1: 250) . Ver Tabela 1 para obter mais detalhes. Lavar anticorpos primários não ligados para 5 x 10 min com DPBS. Incubar as células durante 1 h à temperatura ambiente com o anticorpo secundário fluorescente marcado adequado, como detalhado na Tabela 1 (todos a 1: 200). Lavar anticorpos secundários não ligadas por 5 x 10 min com DPBS. Incubar as células com 1 ug / ml de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) em DPBS durante 10 min à TA. Lavar as células com DPBS durante mais 3 x 5 min. Células de imagens em 100x, utilizando um microscópio invertido equipado com uma fonte de luz externa para excitação de fluorescência, e capturar imagens usando uma anexaçãocâmera digital para posterior análise ed offline. 8. congelamento e descongelamento PBMNCs No final da etapa 3.2, após a centrifugação, aspirar o meio e interromper manualmente o sedimento celular com pipetagem repetida cima e para baixo utilizando uma ponta de pipeta P1000. Adicionar 1 ml de meio de congelação, 90% de soro e 10% de DMSO, certificando-se a agitar suavemente para produzir uma suspensão de células. Transferir a suspensão celular para um cryovial e congelar e descongelar conforme descrito na Seção 5.

Representative Results

Isolamento de buffy coat células mononucleares a partir de 60 ml de sangue normalmente produz 100-150×10 6 glóbulos brancos totais. Quando plaqueadas em um único frasco T-75, o grande número de células na suspensão de células não lisadas torna difícil de resolver as células aderentes utilizando microscopia de campo claro individuais. Alterações médias repetidas resultar na depuração de células não-aderentes e permitir a visualização da população aderente de monocítica "precoces" EPCs. No dia 7, o T-75 conterá aproximadamente 7×10 6 destas células aderentes alongados. A partir do dia 7 e 14, as colónias de BOECs deve aparecer dentro do frasco (Figura 2A). Colônias primeiro aparecem como 3 a 5 células adjacentes. Número de colónias excrescência pode variar de 1 a 10 colónias por 60 ml de sangue. Em geral, os doadores mais jovens (isto é, 20-25 anos de idade) tendem a produzir um maior número de colónias de crescimento, que também aparecem anteriormente na cultura.BOECs proliferam a partir deste grupo central de células para formar colónias circulares consistindo de várias centenas de células. As células dentro dessas colônias apresentam uma morfologia clássico cobblestone endotelial. É preferível a passagem colónias iniciais quando eles contêm aproximadamente 1000 células por colónia. Colónias excrescência tipicamente atingir este tamanho de 7 dias após a sua aparência original na cultura. Uma vez que as colónias originais são passadas para um novo frasco T-75, eles devem proliferam para formar uma monocamada confluente (3-5×10 6 células por frasco) em menos de 5 dias ou menos (Figura 2B). Em uma pequena porcentagem de isolamentos (<10%), colônias conseqüência não aparecem, ou não proliferam suficientemente seguindo este passo inicial passaging. BOECs que apresentam baixo proliferação após a sua primeira passaging raramente passam a se tornar isolamentos BOEC estáveis ​​e muitas vezes param de proliferar dentro de dois a três passagens. O monocyticEPCs primeiros contidos dentro das culturas BOEC são não-proliferativa e são tipicamente apuradas a partir das culturas num período de 1-2 passagens. Liquidação destas células precoces é devido à morte das células, a insuficiência das células iniciais para re-aderir depois passaging e diluição dos primeiros EPCs não-proliferativas com passagens repetidas. A passagem 1 células podem ser passadas mais em cultura congelada ou para baixo para uso posterior. Uma vez que o isolamento estável é gerado, as células podem ser passadas a uma taxa de 1 frasco confluente de 3-5 novos frascos T-75 até passagem 8 ou 9, antes de se tornar quiescente. Mais uma vez, a densidade celular é crítica ao longo de cultura. Em nossa experiência, nada menos do que 750.000 células devem ser colocadas em um frasco T-75, como densidades celulares mais baixas podem causar a paragem do crescimento. Apesar do alto potencial proliferativo de BOECs, as células também não deve ser permitido tornar-se overconfluent (ie.,> 5×10 6 células por frasco), pois isso pode causar convers ião de BOECs para um fenótipo não-proliferativa. Propomos que qualquer célula que está sendo rotulado como um BOEC deve exibir superfície celular apropriada e coloração intracelular para marcadores endoteliais. Caracterização de BOECs pode ser conseguido por citometria de fluxo (Figura 3) ou microscopia de fluorescência (Figura 4), ​​após coloração para marcadores de células endoteliais típicos. BOECs são positivos para o CD31 marcadores de superfície endotelial e VEGFR2 e são negativos para o marcador CD14 monócitos e pan-leucócitos CD45 marcador. BOECs também posess corpos de Weibel-Palade e, assim, expressar fator de von Willebrand (vWF) como, coloração citoplasmática pontuada discreta. Ao contrário de outros tipos de células endoteliais maduras, tais como a artéria pulmonar ou células endoteliais aórticas, BOECs também expressam o marcador de células progenitoras e de activação CD34 na sua superfície. ftp_upload / 53384 / 53384fig1.jpg "/> Figura 1. Diagrama esquemático do protocolo de geração BOEC. As células mononucleares de sangue periférico são isolados a partir de sangue venoso por centrifugação com gradiente de densidade e cultivadas em placas revestidas com colagénio em meio de crescimento endotelial contendo FBS definido. Colónias BOEC aparecer dentro de 7-14 dias de cultura. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2. Imagens de campo claro de culturas BOEC representativas. (A) colônias conseqüência aparecer nas culturas entre os dias 7 e 14. As colónias apresentam como colecções de células endoteliais-like, que são dispostos em uma monocamada de paralelepípedos e proliferam radialmente para fora a partir de um ponto central. Ao redor das colônias conseqüência são os mono aderentecytic células que constituem a grande maioria das células em culturas iniciais. Estas células, previamente descritos como "precoce" células progenitoras endoteliais, têm uma morfologia fusiforme e expressar o marcador CD14 monocytic. (B) Na sequência passaging, os BOECs altamente proliferativas assumir culturas, como as células monocíticas não-proliferativa quer morrer ou deixar de voltar a ligar depois passaging. Scale bar 250 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3. Caracterização de BOECs por citometria de fluxo. BOECs foram tripsinizadas e marcadas com anticorpos de controlo de isotipo conjugados com fluorescência (Gray pico a cheio) ou de anticorpos dirigidos contra marcadores de superfície específicos (linha vermelha). Marcadores de superfície para a caracterização de citometriaincluem os marcadores hematopoiéticas CD45 e CD14, os marcadores endoteliais CD31 e VEGFR2 eo progentior e marcador de ativação endotelial CD34. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4. Immunofluorescent coloração de BOECs para marcadores de células endoteliais. Imagens de imunofluorescência representativos de BOECs imunocoradas com anticorpos dirigidos contra marcador da superfície das células endoteliais CD144 (VE-caderina, o painel superior direito) e da glicoproteína sangue Fator de von Willebrand (vWF, painel inferior direito) . Painéis correspondentes que mostram a coloração DAPI nuclear estão apresentados à esquerda. Scale bar 50 um. para CD144. Por favor clique aqui para ver um maiorversão desta figura.

Discussion

We present a detailed protocol that allows for the robust and efficient derivation of BOECs from adult peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs). Our protocol includes two important refinements that represent advances on previous methods of BOEC isolation.^14-16 These include the absence of heparin in the initial PBMNC culture medium and the use of defined, embryonic stem cell-qualified serum. This latter refinement is of particular importance. Embryonic stem cell (ESC)-qualified serum is a more consistent grade of serum and, although it is not known yet what component(s) are enriched in the serum that benefit BOEC isolation, the impact of this defined serum on the efficiency of BOEC generation is clear in our hands. In addition, we have also had success in isolating BOECs using human serum, thereby allowing for the generation of BOECs for clinical translation. In our hands, this refined protocol results in the successful isolation of stable BOEC cultures from greater than 90% of donors, making it one of the most reliable BOEC generation methods reported thus far. Although the use of particular sera is critical to BOEC generation, it also represents a primary limitation of the current protocol. Future improvements to the technique could include the generation of these cells in serum-free, defined culture conditions.

Critical Steps in the protocol include processing blood samples as soon as possible after collection, complete harvesting of the buffy coat cells after density gradient centrifugation and the timely passaging of initial colonies from P0 to P1. This passaging step is critical to establishment of a stable isolation. Like other endothelial cells, BOECs appear to be very sensitive to plating density. If the plating density after passaging is too low, the BOECs will not proliferate. Conversely, if the colonies are allowed to become overconfluent before passaging, the cells will also cease to proliferate and have the tendency to convert into an elongated, mesenchymal cell phenotype. If few colonies appear from days 7 to 14, or if the colonies are small in size, troubleshooting can include increasing cell density by passaging P0 colonies into a T-25 flask instead of a T-75.

Once the technique is mastered, the resultant BOECs can be used in several applications, including in vitro studies of endothelial cell biology, disease modeling and drug screening, as well as in vivo cell transplantation therapies. An important consideration for the development of any cell therapy process is to use cells that are free from pathogenic mutations. We have previously shown that BOECs isolated using our protocol possess genomes that are free from copy number variations and are thus representative of the individual from which they were collected. In addition, we have also demonstrated that the majority of BOEC-derived iPSC lines are free from copy number variations.¹³ This contrasts with previous reports of copy number variation in fibroblast-derived iPSCs. To date, these cells remain the only iPSCs for which this degree of genomic fidelity has been reported. This feature is important for the field of iPSC biology and the use of iPSCs in disease modeling, drug screening and future cell transplantation therapies.

Materials

For blood collection
60 mL syringe with luer-lok tip	BD	309653
19G Surflo Winged Infusion Set	Terumo	SV-19BL
50 mL conical centrifuge tube	StarLab	E1450	2 per donor
Sodium Citrate	Martindale Pharmaceuticals	270541
Name	Company	Catalog Number	Comments
For buffy coat isolation
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03
Dulbecco’s PBS (without Ca2+ and Mg2+)	Sigma-Aldrich	D8537
Sterile wrapped plastic transfer pipettes	Appleton Woods	KC231
Turk’s Solution	Millipore	1.093E+09
Name	Company	Catalog Number	Comments
For cell culture, passaging and freezing cells
Type 1 Collagen (derived from rat tail)	BD Biosciences	35-4236
Dulbecco’s PBS (without Ca2+ and Mg2+)	Sigma-Aldrich	D8537
0.02M Acetic Acid	Sigma-Aldrich	A6283	prepared in reagent grade water
Endothelial Growth Medium-2MV (containing Bullet Kit, but not serum)	Lonza	CC-3202	Note: It is essential that the medium does not contain heparin.   Do not use EGM-2.
Fetal Bovine Serum (U.S.), Defined	Hyclone	SH30070
10x Trypsin EDTA	Gibco	T4174	Dilute to 1x in PBS prior to use
Heat Inactivated FBS	Gibco	10500-064
DMEM	Gibco	41965-039
DMSO	Sigma-Aldrich	276855
Nalgene Mr. Frosty Freezing Container	Sigma-Aldrich	C1562
Name	Company	Catalog Number	Comments
For flow cytometric characterization
FITC-conjugated mouse anti-human CD14	BD Biosciences	555397	Mouse IgG1k, Clone: WM59 Dilution: 1:20
FITC-conjugated mouse anti-human CD31	BD Biosciences	555445	Mouse IgG1k, Clone: WM59 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse anti-human CD34	BD Biosciences	555824	Mouse IgG1k, Clone: 581/CD34 Dilution: 1:20
FITC-conjugated mouse anti-human CD45	BD Biosciences	560976	Mouse IgG1k, Clone: HI30 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse anti-human VEGFR2	R&D Systems	FAB357A	Mouse IgG1, Clone: 89106 Dilution: 1:10
FITC-conjugated mouse IgG1k isotype control	BD Biosciences	555748	Clone: MOPC-21 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse IgG1k isotype control	BD Biosciences	555751	Clone: MOPC-21 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse IgG1k isotype control	R&D Systems	IC002A Dilution: 1:10	Clone: 11711
EDTA, 0.5M solution	Sigma-Aldrich	E7889
Name	Company	Catalog Number	Comments
For immunofluorescent microscopy
Corning Costar 24-well tissue culture plate	Sigma-Aldrich	CLS3527
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
BSA	Sigma-Aldrich	A7906
Polysorbate 20	Sigma-Aldrich	P2287
Monoclonal mouse anti-human CD34 antibody	R&D Systems	MAB72271	Clone 756510, IgG1, use at 10 μg/ml
Polyclonal goat anti-human VE-cadherin (CD144)	R&D Systems	AF938	Antigen affinity- purified IgG, use at 1:300
Monoclonal rabbit anti-human Von Willebrand Factor (vWF)	Abcam	ab154193	Clone EPSISR15, use at 1:250
Donkey anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-21202	Polyclonal, 2 mg/ml, use at 1:200
Donkey anti-goat IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-11055	Polyclonal, 2 mg/ml, 1:200
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate	Life Technologies	A-10042	Polyclonal,  2 mg/ml, 1:200
DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma-Aldrich	D9542	use at 1 μg/ml