דור והתרבות של דם תולדה תאי אנדותל מאדם דם היקפי

Summary

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

Abstract

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

Introduction

עד לאחרונה, הדור שלאחר הלידה של כלי דם החדשים היה האמין להתרחש אך ורק באמצעות תהליך המכונה אנגיוגנזה כ, מוגדר כהנבטה של כלי דם חדשים מתאי האנדותל של כלי קיימים מראש. ¹ תהליך זה מנוגד מvasculogenesis, או היווצרות דה נובו של כלי דם מהאבות אנדותל, שחשבו שיתרחשו באופן בלעדי בעובר. ² עם זאת, מחקרים שנעשה לאחרונה יותר זיהו ומבודדים במחזור תאי האנדותל אב (EPCs) בדם ההיקפי של מבוגרים. תאים אלה יש את היכולת להתמיין לתאי אנדותל בוגרים בתרבות ובהם האמינו להשתתף בvasculogenesis לאחר הלידה. ^3,4

פרוטוקולים לבידוד והרחבת EPCs אלה בדרך כלל כרוכים בתרבות של תאים ההיקפיים mononuclear הדם (PBMNCs) בתקשורת המכילים גורמי גדילת אנדותל, כולל vasculגורם ar אנדותל צמיחה (VEGF) וצמיחה פיברובלסטים גורם-2. ^5-8 תרבויות EPC לייצר מגוון רחב של סוגים שונים באופן דרמטי תא. תרבויות ראשוניות (<7 ימים) נשלטות על ידי סוג תא monocytic, ידוע בספרות כ" מוקדם "EPCs. למרות שמם, תאים אלה מבטאים את סמן CD14 מונוציטים, הם שליליים עבור CD34 סמן האב ולהביע את הרמות מזעריות בלבד של CD31 הקלאסי אנדותל הסמנים וVEGF קולט 2 (VEGFR2). ⁵ תרבות המשך מולידה אוכלוסייה משנית של תאים, ידוע כEPCs מאוחר תולדה או תאי האנדותל תולדת דם (BOECs), המופיעים מושבות דיסקרטיות לתאי האנדותל כמו-. בניגוד לEPCs המוקדם monocytic, BOECs, שגם היה נקרא תאי האנדותל מושבה להרכיב (ECFCs), תאי האנדותל תולדה או תאי האנדותל מאוחר תולדה, התערוכה המורפולוגיה המרוצפת שאופייני לmonolayers תא אנדותל ודומה מאוד בסמן משטח5 וגן ביטוי ⁹ להבשיל לתאי אנדותל.

הדור של תאי האנדותל כמו-מהדם היקפי מציע מספר יתרונות, במיוחד לחקר תפקוד התא האנדותל קשור עם הפרעות כלי דם כגון יתר לחץ דם עורקי ריאתי (PAH) ¹⁰ או פון Willebrand מחלה. ¹¹ לפני הזמינות של BOECs, אנדותל תאים יכולים לנבוע רק מאיברי explanted בעת מוות או השתלת איבר, או מבודד מוריד הטבור בלידה. זמינות מופחת מיוצג מגבלה רצינית להבנת הביולוגיה של תאי האנדותל מחולים עם הפרעות לב וכלי דם, כמו גם את יחסי הגומלין בין תאי האנדותל וגם תאי דם או תאי ציור קיר. יתר על כן, הבידוד וculturing אוכלוסייה טהורה של תאי האנדותל ממקורות אלה הוא מאתגרים מבחינה טכנית והתאים שהופקו על ידי שיטות אלה מפגינים רק limiteיכולת שגשוג ד. BOECs לכן מציע תחליף בעל ערך לבידוד והתרבות של תאי האנדותל עיקריים הנגזר מטופל.

בנוסף ליישומים שלהם במבחנה, BOECs גם שעשוי להיות שימושי בטיפולי השתלה אוטולוגית של תאים. יישומים אלה כוללים שתי השתלת אנדותל התא לקדם neovascularization (ראה ¹² והפניות בו), כמו גם את הדור של תאי גזע pluripotent מושרה (iPSCs). ¹³ iPSCs נגזר BOEC יכול לשמש לדוגמנות מחלה ומציעים פוטנציאל עצום כהתחלה חומר לטיפולים בתאים אוטולוגית. BOECs לתכנת מחדש מהר יותר ועם יעילות גבוהה יותר מאשר fibroblasts עור. יתר על כן, BOECs גם לאפשר לדור של iPSCs שהם ללא חריגות karyotypic, אשר היא תכונה חיונית של כל טכנולוגיה שתהיה מתאים ליישומי translational. היכולת ליצור iPSCs מדגימת דם חולההסימפונית מבטל את הצורך בביופסיה של עור ואת הדור של fibroblasts עור, ובכך להקל על הדור של תאים מחולים עם הפרעות ריפוי פצע, או צעירות מאוד.

הפרוטוקול המפורט להלן, שאושר על ידי ונערך בהתאם להנחיות ועדת האתיקה הלאומית למחקר השירות (מזרח אנגליה), מספק שיטה פשוטה ואמינה לדור של BOECs ביעילות רבה יותר מ -90% מנפח קטן יחסית (60 מיליליטר) של דם היקפי. תאים אלה הם שגשוג מאוד ויכולים להיות passaged שוב ושוב, ומאפשרים לדור של מאה מיליון תאים מדגימת דם אחת.

Protocol

סכמטי של פרוטוקול דור BOEC מוצג באיור 1. צנטריפוגה שיפוע אוסף וצפיפות 1. דם לכל תורם, להוסיף 3 מיליליטר של נתרן ציטרט לכל אחד מצינורות צנטריפוגות חרוטי שני 50 מיליליטר. לאסוף 60 מיליליטר של דם על ידי venipuncture ולהוסיף 30 מיליליטר לכל צינור. היפוך בעדינות 2-3 פעמים כדי לערבב. השתמש קטן כמו 40 מיליליטר של דם בפרוטוקול, עם כרכי ציטראט בהתאם. הערה: זה חיוני כי דגימות דם מעובדות בתוך 2 שעות של אוסף. מושהה עיבוד של תוצאות דם בירידה ניכרת בתשואת מושבה תולדה. הכן צינורות חרוטי חדשים המכילים בינוני צנטריפוגה שיפוע צפיפות על ידי היפוך הראשון הבקבוק כמה פעמים כדי לערבב. במנדף סטרילי, להוסיף 15 מיליליטר של מדיום צנטריפוגה שיפוע צפיפות לצינור חרוטי 50 מיליליטר (1 צינור לכל 10 מיליליטר של דם, 6 צינורות לתורם). לדלל דם 1: 1 עם פוספט Dulbecco שלמלוח -Buffered (DPBS). הטה את הצינור המכיל מדיום צנטריפוגה שיפוע צפיפות לזווית של 20 מעלות עם משטח העבודה. באמצעות סיוע פיפטה וטפטף סרולוגיות 25 מיליליטר, שכבה לאט 21 מיליליטר של דם מדולל על גבי המדיום על ידי הוספת דם בהדרגה במורד הקיר של הצינור הנטוי. הערה: אם תעשה זאת תהיה למזער ערבוב של הדם עם שכבת שיפוע צפיפות ויפיק מעיל הדוק באפי, כמו גם תשואה משופרת. דגימות צנטריפוגה ב 400 XG במשך 35 דקות ב RT עם המאיץ והבלם מ. במהלך תקופה זו צנטריפוגה, להתחיל ציפוי קולגן המפורט בצעדים 2.1-2.4. להבטיח את השלבים הבאים כבר הושלמו לפני שימשיכו לשלב 3.1. 2. קולגן ציפוי של T-75 בקבוק והכנה של תרבות בינונית הערה: בצע את השלבים הבאים במכסת מנוע תרבית תאים. הכן פתרון קולגן / מיליליטר 50 מיקרוגרם ידי דילול המניות טאיpe אני קולגן 10 מיליליטר של 0.02M חומצה אצטית דוגמא:. למניית קולגן בריכוז של 4.05 מ"ג / מיליליטר, להוסיף 123.5 μL של קולגן 10 מיליליטר של חומצה אצטית 0.02 M. ההשעיה קולגן סינון סטרילי לפני השימוש. בעזרת פיפטה סרולוגיות, להוסיף 7.5 מיליליטר של תמיסת קולגן לבקבוק תרבית תאי T-75. נפח זה נותן 5 מיקרוגרם קולגן / 2 סנטימטר (או 375 מיקרוגרם / בקבוק). בקבוק מעיל עבור שעה 1 ב RT. הכן את מדיום גידול האנדותל המשמש לייצור BOEC ידי השלמה בינונית בסיסי אנדותל עם תוספי גורם גדילה הניתנים על ידי היצרן. הוסף את כל התוספים, אבל לא להוסיף סרום. כדי להכין 15 מיליליטר של מדיום דור BOEC, להוסיף 2.5 מיליליטר של סרום שור עוברי מוגדר (FBS) 12.5 מיליליטר של מדיום גידול האנדותל המכיל תוספי גורם גדילה. להמשיך בצעדים המפורטים בסעיף 3. לאחר תקופה ציפוי 1 שעה, לשאוב את פתרון קולגן ולשטוף את החומצה אצטית שייר ידי pipettingב 10 DPBS מיליליטר. לשאוב את DPBS וחזור על שלב זה לשטוף פעם נוספת. אם ההשעיה התא שהושגה במהלך שלב 3.3 אינה מוכנה לציפוי בשלב זה, להוסיף 5 מ"ל של מדיום דור BOEC לבקבוק כדי לשמור על ציפוי קולגן מהתייבשות. 3. איסוף וציפוי של PBMNCs בעקבות צנטריפוגה שיפוע צפיפות המתוארת בשלב 1.4, לאסוף בזהירות את שכבת מעיל באפי בעזרת פיפטה העברה פלסטיק סטרילי. אוסף של המעיל באפי אמור להניב כ 20 מיליליטר של השעיה תא ופלזמה מצינור אחד. הימנע העברה בינוני שיפוע צפיפות. לדלל את ההשעיה תא mononuclear 1: 1 בDPBS ולהפוך לערבב. צנטריפוגה ב RT במשך 20 דקות ב 300 XG עם בלם ודוושת גז במקסימום. בעקבות צנטריפוגה, לשאוב את תאי supernatant וגלולים על ידי הוספת 1 מיליליטר של מדיום דור BOEC לכל גלולה וpipetting למעלה ולמטה שוב ושוב. תא בריכת השעיותהעליון עד נפח כולל ד עד 10 מיליליטר עם המדיום שנותר. כדי לקבל הערכה של מספר הכולל של תאים, מדגם 10 μl של השעיה תא ולדלל 50x עם 490 μl של הפתרון של טורק, שlyse תאי דם אדומים. רוזן מדגם 10 μl של ההשעיה התא המדולל באמצעות haemocytometer. הערה: 60 מ"ל של דם אמור להניב כ 100-150 x 10 6 תאי דם לבנים לציפוי. השעיה צלחת כל תא לבקבוק T-75 בודד, מצופה קולגן, נפח העליון עד בינוני ל15 מ"ל / בקבוק ותרבות על 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified המכילה 5% CO 2. תאים מצופים בשלב זה מייצגים מעבר 0. הערה: אפשר להקפיא את PBMNCs המבודד לפני בידוד BOEC כדי לגזור את BOECs במועד מאוחר יותר או כדי להעביר את PBMNCs למעבדה שונה שבי יכול להיות שנוצרה BOECs. עם זאת, חשוב לשים לב כי PBMNCs הקפאה יכולה להפחית את היעילות של בידוד BOEC. Sסעיף 8 להלן EE לשיטה. תרבית תאים 4. לטווח ארוך שנה בינונית כל 2 ימים על ידי הוספת 15 מיליליטר של מדיום דור BOEC הטרי (5: 1 תערובת של מדיום גידול תא האנדותל ומוגדר FBS). לסופי שבוע, יכולים להתעכב שינויים בינוניים לכל 3 ימים. הערה: מושבות תולדה אמורות להופיע בין 7 ו -14 ימים של התרבות. צג בקבוק תרבות BOEC בימים 7-14 להופעתו של מושבות תולדה. לזהות מושבות כקבוצות מעגליות של תאים מציגות מורפולוגיה מרוצפת אנדותל קלאסית. ברגע שמושבה או במושבות מרובות מזוהות בבקבוק, תמשיך עם שינויים בינוניים ולאפשר מושבות לגדול לכ 1000-2000 תאים לכל מושבה לפני passaging. לקבוע את המספר הסלולרי למושבה דרך אומדן חזותי גס. הערה: כמדריך, נהוג מושבות תולדה ראשוניות מעבר שבוע לאחר זיהוי של המושבה תולדה הראשונה. <li> תאי מעבר על ידי שטיפת צלוחיות פעמיים עם 10 מיליליטר של DPBS. הוסף 5 מיליליטר של 1X טריפסין-EDTA ודגירה בחממה 37 ° C במשך 5 דקות. לאחר 5 דקות, לנטרל טריפסין עם 10 מיליליטר של מדיום (המכיל FBS) ולהביא להשעית תאים עם pipetting חוזר ונשנה. ההשעיה צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות, resuspend ב 15 מיליליטר של מדיום דור BOEC הטרי וצלחת ההשעיה תא כולו לT-75 בקבוק חדש (המייצג מעבר 1, P1). אין ציפוי קולגן נדרש. המשך שינויים בינוניים כמתואר לעיל עד תאים (בערך 3-5 x 10 6 תאים לכל בקבוק) ומחוברות. ברגע שמחוברות, תאי מעבר כמתואר בשלב 4.3. הערה: ממעבר 2 ואילך, תאים כבר לא דורשים בינוני דור BOEC ויכולות להיות מתורבת במדיום גידול תא האנדותל וFBS חום מומת הסטנדרטי של 10%. ציפוי קולגן יכול לשמש כצעד אופציונאלי הולך קדימה, כמו שיש ראיות לכך שהנוכחות של קולגן יכולה לשפר prolifer BOECשיעורי ני. לpassaging המשך, צלחת לא פחות מ 750,000 תאים לכל T-75 בקבוק כצפיפות תא נמוך יכולה לגרום BOECs להפסיק מתרבים. 5. הקפאה והפשרת תרבויות BOEC Trypsinize תאים כפי שתואר בסעיף 4.3 ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות. לשאוב supernatant וגלול ב 10 מיליליטר של מדיום. זה אינו דורש בינוני צמיחת תאי אנדותל; DMEM עם FBS הסטנדרטי 10% יהיה מספיק. לאסוף דגימת 10 μl של ההשעיה התא לבצע ספירת תאים ידנית באמצעות haemocytometer. צנטריפוגה שוב וגלול ב2×10 6 תאים / מיליליטר במדיום הקפאה קר כקרח (DMEM 40% FBS עם 50% ו -10% DMSO). הוסף 0.5 מיליליטר (10 6 תאים) לכל בקבוקון, בקבוקוני מקום בכלי קרח isopropanol הקרה הקפאה ומקום במקפיא -80 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות לפני העברה לחנקן נוזלי. אל תשאירו תאים ב -80 ° C במשך יותר מ 24 שעות. </li> להפשיר תאים, להוסיף 10 מיליליטר של מדיום מראש חימם לצינור צנטריפוגות חרוטי 15 מיליליטר. הערה: כאשר מפשירים את המעבר 1 תאים, להפשיר למדיום גידול תא האנדותל בתוספת 20% הגדירו FBS עבור 2 הימים הראשונים לאחר הפשרה. זה מוביל לבידוד תא יציב יותר הולך קדימה. הסרת תאים מחנקן נוזלי והפשרה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה עד שרק גביש קרח קטן שנשאר בבקבוקון. מוסיף את תכולת בקבוקון ירידה מבחינת לצינור צנטריפוגות חרוטי וספין למטה XG ב 300 במשך 5 דקות. לשאוב supernatant ותא גלולה גלול בFBS + 10% 10 מיליליטר EGM-2MV. הוסף לבקבוק T-75 ועליון עד בינוני עד 15 מיליליטר. 6. אפיון BOECs ידי cytometry הזרימה ברגע שמושבות BOEC המתואר בסעיף 4 כבר מותרת להרחיב, trypsinize תאים כפי שתוארו בסעיף 4.4 וגלול בריכוז של 10 6 תאים למ"ל במאגר מכתים (שנינות DPBSh 2% FBS ו -2 מ"מ EDTA). לשלב 10 5 תאים עם נוגדני fluorochrome מצומדות המכוונים נגד (כל שעת 1:20 דילול שימוש) CD45, CD14, CD34, CD31 או VEGFR2 (לדלל 01:10) (ראה טבלה 1 לפרטים מלאים). דגירה של 30 דקות ב 4 ° C בחושך. לשטוף את התאים עם 1 מיליליטר מכתים חיץ צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות. לשאוב supernatant וגלול ב400 חיץ מכתים μl לניתוח. שמור את התאים ב 4 מעלות צלזיוס ומוגנות מפני אור לפני הניתוח. ביצוע ניתוח cytometric על cytometer המצויד כדי לזהות את הנוגדנים מצומדות fluorescently בשימוש assay. השתמש במדגם BOEC בלא כתם לזהות אוכלוסיית התא על cytometer ידי התאמה קדימה ומתחי צד פיזור, כמו גם המתחים לערוצי FITC וAPC. לקבוע gating ספים באמצעות תאי אלוטיפ מוכתם לכל fluorochrome. להעריך חיובי עבור כל סמן פני תא המבוסס על presencדואר של משמרת שיא בעוצמת הקרינה לעומת שליטת אלוטיפ לfluorochrome להיות מנותח. 7. אפיון BOECs ידי Immunofluorescent מיקרוסקופית BOECs צלחת ב24-היטב, צלחת תרבית רקמה שטוח תחתונה ללא coverslips בצפיפות של 5 x 10 4 תאים ב500 μl של מדיום גידול תא האנדותל + 10% FBS בכל טוב ולהשאיר לדבוק ולגדול ב 37 חום מומת מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד תאים לכסות לפחות 70-80% משטח הפנים של כל טוב (confluency הערכה על ידי בדיקה ויזואלית תחת microsope אור). לשטוף את התאים בכל טוב במשך 5 דקות עם 1 מיליליטר של DPBS. תקן תאי O / N ב 4 ° C עם 500 μl של 4% פתרון paraformaldehyde בDPBS. לשטוף את התאים במשך 3 x 5 דקות עם 1 מיליליטר של DPBS בכל טוב. הוספה והסרה של DPBS בעזרת פיפטה וaspirator, בהתאמה. Permeabilize תאים עבור 3 x 10 דקות עם 0.2% polysorbate 20 בDPBS. </li> דגירה תאים עבור שעה 1 ב RT בחסימת מאגר המכיל 10% FBS בDPBS. תאי כתם על 4 מעלות CO / N 300 μl של חיץ דילול נוגדן (0.1% אלבומין בסרום השור בDPBS) המכיל נוגדנים עיקריים המכוונים נגד CD34 (10 מיקרוגרם / מיליליטר), CD144 (1: 300) או vWF (1: 250) . ראה טבלת 1 לפרטים מלאים. לשטוף את הנוגדנים מאוגד עיקריים במשך 5 x 10 דקות עם DPBS. דגירה תאים עבור שעה 1 ב RT עם הנוגדנים משני שכותרתו fluorescently המתאימים, כמפורט בטבלה 1 (כל יום 1: 200). לשטוף את הנוגדנים משני מאוגד ל5 x 10 דקות עם DPBS. דגירה תאים עם 1 מיקרוגרם / מיליליטר 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) בDPBS במשך 10 דקות ב RT. לשטוף את התאים עם DPBS לדקות 3 x 5 נוספות. תאי תמונה בהגדלה 100x באמצעות מיקרוסקופ הפוכה מצוידת במקור אור חיצוני לעירור הקרינה, וללכוד תמונות באמצעות לצרףמצלמה דיגיטלית אד למחובר ניתוח שלאחר מכן. 8. PBMNCs ההקפאה להפשרה בסופו של שלב 3.2, בעקבות צנטריפוגה, לשאוב את המדיום וידני לשבש את התא גלולה עם pipetting למעלה חזר ולמטה באמצעות קצה פיפטה P1000. הוסף 1 מיליליטר של מדיום הקפאה, סרום 90% וDMSO 10%, והקפד לערבב בעדינות כדי לייצר השעיה תא. מעבירים את ההשעיה התא לcryovial ולהקפיא ולהפשיר כאמור בסעיף 5.

Representative Results

בידוד של תאי mononuclear המעיל באפי מ- 60 מיליליטר של דם בדרך כלל תשואות 100-150×10 6 תאי דם לבנים הכולל. כאשר מצופה לתוך T-75 בקבוק אחד, המספר הגדול של תאים בתרחיף תאי unlysed מקשה לפתור תאים חסיד פרט באמצעות מיקרוסקופ brightfield. שינויים בינוניים חזרו לגרום לשחרור של תאים שאינם חסיד ולאפשר להדמיה של האוכלוסייה חסיד של monocytic "מוקדם" EPCs. ביום 7, T-75 יכילו כ 7×10 6 תאים חסיד המוארכים אלה. מיום 7 עד 14, מושבות של BOECs אמורות להופיע בתוך הבקבוק (איור 2 א). מושבות יופיעו כ3 עד 5 תאים סמוכים ראשונה. מספר מושבה תולדה יכול להשתנות 1-10 מושבות בכל 60 מיליליטר של דם. בדרך כלל, תורמים צעירים (כלומר, 20-25 שנים) נוטים לייצר מספר גדול יותר של מושבות תולדה, שגם מופיעות מוקדם יותר בתרבות.BOECs להתרבות מקבוצה מרכזית זו של תאים ליצור מושבות עגולות בהיקף של כמה מאה תאים. תאים בתוך מושבות אלה מפגינים מורפולוגיה מרוצפת אנדותל קלאסית. עדיף מושבות ראשוניות מעבר כאשר הם מכילים כ 1000 תאים לכל מושבה. מושבות תולדה בדרך כלל להגיע לגודל זה 7 ימים לאחר ההופעה המקורית שלהם בתרבות. ברגע שהמושבות המקוריות passaged לתוך T-75 בקבוק חדש, הם צריכים להתרבות בצורת monolayer ומחוברות (3-5×10 6 תאים לכל בקבוק) בתוך 5 ימים או פחות (איור 2). באחוז קטן של בידודים (<10%), מושבות תולדה אינן מופיעות, או לא מספיק להתרבות הבא צעד passaging ראשוני זה. BOECs כי התערוכה התפשטות נמוכה לאחר passaging הראשון שלהם כמעט ולא ללכת על מנת להפוך בידודי BOEC יציבים ולעתים קרובות להפסיק מתרבים בתוך שנים עד שלושה קטעים. MonocyticEPCs המוקדם בתוך תרבויות BOEC הינו ללא שגשוג ונמחקים בדרך כלל מהתרבויות בתוך 1-2 קטעים. חיסול של תאים מוקדמים אלו נובע מוות של תאים, כישלון של התאים המוקדמים מחדש לדבוק לאחר passaging ודילול של EPCs המוקדם אינו השגשוג עם passaging חוזר ונשנה. או יכולים להיות passaged תאי 1 מעבר נוסף בתרבות או קפוא מטה לשימוש מאוחר יותר. ברגע שבידוד יציב שנוצר, ניתן passaged תאים בשיעור של בקבוק ומחוברות 1 עד 3-5 T-75 צלוחיות חדשות עד מעבר 8 או 9 לפני שהפכתם שקט. שוב, צפיפות תאים היא קריטית בכל תרבות. מניסיוננו, צריכים להיות מצופים לא פחות מ 750,000 תאים בבקבוק T-75, כפי שצפיפות תא תחתונה יכול לגרום למעצר צמיחה. למרות פוטנציאל השגשוג הגבוה של BOECs, צריכים גם לא יורשו תאים להפוך overconfluent (כלומר.,> 5×10 6 תאים לכל בקבוק) כמו זה יכול לגרום convers יון של BOECs לפנוטיפ הלא שגשוג. אנו מציעים שכל תא שכותרתו כBOEC צריך להציג פני תא מתאים וצביעה תאית לסמנים האנדותל. אפיון של BOECs יכול להיות מושגת על ידי cytometry זרימה (איור 3) או מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 4), הבא מכתים עבור סמני תא האנדותל טיפוסיים. BOECs הם חיוביים עבור CD31 סמני משטח אנדותל וVEGFR2 ושליליים עבור CD14 סמן מונוציטים וCD45 הסמן פאן-יקוציט. BOECs גם posess גופי Weibel-Palade ובכך להביע את פון Willebrand פקטור (vWF) כמכתים בדיד, punctate cytoplasmic. בניגוד לסוגים אחרים בוגרים אנדותל תא, כגון עורק ריאה או תאי האנדותל אב העורקים, BOECs גם להביע את האב וCD34 סמן הפעלה על פני השטח שלהם. ftp_upload / 53,384 / 53384fig1.jpg "/> איור 1. תרשים סכמטי של פרוטוקול דור BOEC. תאי דם היקפי mononuclear מבודדים מהדם ורידים על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות ותרבותי על צלחות מצופים קולגן במדיום גידול האנדותל מכיל מוגדר FBS. מושבות BOEC מופיעות בתוך 7-14 ימים של התרבות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 2. תמונות Brightfield של תרבויות BOEC נציג. () מושבות תולדה מופיעות בתרבויות בין ימים 7 ו -14 מושבות הנוכחיים כאוספים של תאי האנדותל כמו-, אשר מסודרים בשכבה מרוצפת ולהתרבות רדיאלית החוצה מתוך נקודה מרכזית. המקיף את מושבות תולדה הן מונו חסידתאי cytic שמרכיבים את הרוב המכריע של תאים בתרביות מוקדמות. תאים אלה, שתוארו בעבר כ" מוקדם "ותאים אנדותל, יש מורפולוגיה כמו ציר-ולהביע CD14 סמן monocytic. (ב) בעקבות passaging, BOECs השגשוג מאוד להשתלט על תרבויות, כמו התאים monocytic הלא השגשוג או למות או להיכשל לצרף מחדש לאחר passaging. 250μm בר סולם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 3. אפיון של BOECs ידי cytometry זרימה. BOECs היה trypsinized ומוכתם עם נוגדני fluorescently- מצומדות שליטת אלוטיפ (אפור שיא מלא) או נוגדנים מכוונים נגד סמנים ספציפיים משטח (קו אדום). סמני משטח לאפיון cytometricכולל סמני hematopoietic CD45 וCD14, הסמנים האנדותל CD31 וVEGFR2 וprogentior וסמן הפעלת האנדותל CD34. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 4. מכתים Immunofluorescent של BOECs לסמני תא האנדותל. תמונות immunofluorescence נציג של BOECs immunostained עם נוגדנים המכוונים נגד הסמן פני תא אנדותל CD144 (VE-cadherin, פנל ימני עליון) וגליקופרוטאין הדם פון Willebrand פקטור (vWF, פנל ימני תחתון) . לוחות מקבילים מראים מכתים DAPI גרעיני מוצגים בצד השמאל. 50μm בר סולם. לCD144. אנא לחץ כאן לצפייה גדולה יותרגרסה של נתון זה.

Discussion

We present a detailed protocol that allows for the robust and efficient derivation of BOECs from adult peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs). Our protocol includes two important refinements that represent advances on previous methods of BOEC isolation.^14-16 These include the absence of heparin in the initial PBMNC culture medium and the use of defined, embryonic stem cell-qualified serum. This latter refinement is of particular importance. Embryonic stem cell (ESC)-qualified serum is a more consistent grade of serum and, although it is not known yet what component(s) are enriched in the serum that benefit BOEC isolation, the impact of this defined serum on the efficiency of BOEC generation is clear in our hands. In addition, we have also had success in isolating BOECs using human serum, thereby allowing for the generation of BOECs for clinical translation. In our hands, this refined protocol results in the successful isolation of stable BOEC cultures from greater than 90% of donors, making it one of the most reliable BOEC generation methods reported thus far. Although the use of particular sera is critical to BOEC generation, it also represents a primary limitation of the current protocol. Future improvements to the technique could include the generation of these cells in serum-free, defined culture conditions.

Critical Steps in the protocol include processing blood samples as soon as possible after collection, complete harvesting of the buffy coat cells after density gradient centrifugation and the timely passaging of initial colonies from P0 to P1. This passaging step is critical to establishment of a stable isolation. Like other endothelial cells, BOECs appear to be very sensitive to plating density. If the plating density after passaging is too low, the BOECs will not proliferate. Conversely, if the colonies are allowed to become overconfluent before passaging, the cells will also cease to proliferate and have the tendency to convert into an elongated, mesenchymal cell phenotype. If few colonies appear from days 7 to 14, or if the colonies are small in size, troubleshooting can include increasing cell density by passaging P0 colonies into a T-25 flask instead of a T-75.

Once the technique is mastered, the resultant BOECs can be used in several applications, including in vitro studies of endothelial cell biology, disease modeling and drug screening, as well as in vivo cell transplantation therapies. An important consideration for the development of any cell therapy process is to use cells that are free from pathogenic mutations. We have previously shown that BOECs isolated using our protocol possess genomes that are free from copy number variations and are thus representative of the individual from which they were collected. In addition, we have also demonstrated that the majority of BOEC-derived iPSC lines are free from copy number variations.¹³ This contrasts with previous reports of copy number variation in fibroblast-derived iPSCs. To date, these cells remain the only iPSCs for which this degree of genomic fidelity has been reported. This feature is important for the field of iPSC biology and the use of iPSCs in disease modeling, drug screening and future cell transplantation therapies.

Materials

For blood collection
60 mL syringe with luer-lok tip	BD	309653
19G Surflo Winged Infusion Set	Terumo	SV-19BL
50 mL conical centrifuge tube	StarLab	E1450	2 per donor
Sodium Citrate	Martindale Pharmaceuticals	270541
Name	Company	Catalog Number	Comments
For buffy coat isolation
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03
Dulbecco’s PBS (without Ca2+ and Mg2+)	Sigma-Aldrich	D8537
Sterile wrapped plastic transfer pipettes	Appleton Woods	KC231
Turk’s Solution	Millipore	1.093E+09
Name	Company	Catalog Number	Comments
For cell culture, passaging and freezing cells
Type 1 Collagen (derived from rat tail)	BD Biosciences	35-4236
Dulbecco’s PBS (without Ca2+ and Mg2+)	Sigma-Aldrich	D8537
0.02M Acetic Acid	Sigma-Aldrich	A6283	prepared in reagent grade water
Endothelial Growth Medium-2MV (containing Bullet Kit, but not serum)	Lonza	CC-3202	Note: It is essential that the medium does not contain heparin.   Do not use EGM-2.
Fetal Bovine Serum (U.S.), Defined	Hyclone	SH30070
10x Trypsin EDTA	Gibco	T4174	Dilute to 1x in PBS prior to use
Heat Inactivated FBS	Gibco	10500-064
DMEM	Gibco	41965-039
DMSO	Sigma-Aldrich	276855
Nalgene Mr. Frosty Freezing Container	Sigma-Aldrich	C1562
Name	Company	Catalog Number	Comments
For flow cytometric characterization
FITC-conjugated mouse anti-human CD14	BD Biosciences	555397	Mouse IgG1k, Clone: WM59 Dilution: 1:20
FITC-conjugated mouse anti-human CD31	BD Biosciences	555445	Mouse IgG1k, Clone: WM59 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse anti-human CD34	BD Biosciences	555824	Mouse IgG1k, Clone: 581/CD34 Dilution: 1:20
FITC-conjugated mouse anti-human CD45	BD Biosciences	560976	Mouse IgG1k, Clone: HI30 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse anti-human VEGFR2	R&D Systems	FAB357A	Mouse IgG1, Clone: 89106 Dilution: 1:10
FITC-conjugated mouse IgG1k isotype control	BD Biosciences	555748	Clone: MOPC-21 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse IgG1k isotype control	BD Biosciences	555751	Clone: MOPC-21 Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse IgG1k isotype control	R&D Systems	IC002A Dilution: 1:10	Clone: 11711
EDTA, 0.5M solution	Sigma-Aldrich	E7889
Name	Company	Catalog Number	Comments
For immunofluorescent microscopy
Corning Costar 24-well tissue culture plate	Sigma-Aldrich	CLS3527
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
BSA	Sigma-Aldrich	A7906
Polysorbate 20	Sigma-Aldrich	P2287
Monoclonal mouse anti-human CD34 antibody	R&D Systems	MAB72271	Clone 756510, IgG1, use at 10 μg/ml
Polyclonal goat anti-human VE-cadherin (CD144)	R&D Systems	AF938	Antigen affinity- purified IgG, use at 1:300
Monoclonal rabbit anti-human Von Willebrand Factor (vWF)	Abcam	ab154193	Clone EPSISR15, use at 1:250
Donkey anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-21202	Polyclonal, 2 mg/ml, use at 1:200
Donkey anti-goat IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-11055	Polyclonal, 2 mg/ml, 1:200
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate	Life Technologies	A-10042	Polyclonal,  2 mg/ml, 1:200
DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma-Aldrich	D9542	use at 1 μg/ml