Optimalisering av Wound Scratch analysen å oppdage endringer i Murint Mesenchymale stromal Cell Migration Etter Skade ved Løselig sigarettrøyk Extract

Summary

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

Abstract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

Introduction

Cellemigrering er koordinert og meget viktig for mange fysiologiske prosesser slik som vev utvikling, reparasjon og regenerasjon samt patologiske prosesser slik som cancer metastase og arteriosklerose ^1. En forståelse av cellemigrasjon er særlig relevant for nye behandlingsformer som brukes til å reparere skadet vev og behandle patologiske tilstander, inkludert celletransplantasjon teknologier og kunstig vev pode ^2. Gitt den nåværende interesse i rollen mesenchymale stromaceller (MSC) i formidling vev reparasjon ^3, kvantifisere den vandrende kapasitet på disse cellene ved hjelp av en metode som er strengt kvantifiserbare, tilpasningsdyktig, og kostnadseffektiv er av interesse. Viktigere, må en slik analyse er tilstrekkelig følsomt til å detektere forholdsvis små endringer i cellulær trekkende kapasitet etter skade. Dagens metoder for å kvantifisere cellemigrasjon, inkludert skrape analyser, trans-brønners migrasjonsanalyser (Boyden chAmbers), micropillar arrays og celle eksklusjon sonen analyser har en rekke begrensninger i reproduserbarhet, skreddersy, kvantifisering og kostnadseffektivitet ^1,4,5. Den optimaliserte scratch analysen beskrevet her demonstrerer robuste resultater, kvantifiserbare og bildebaserte analysemuligheter, kostnadseffektivitet og tilpasning til andre programmer.

Skrape-analyser er blitt brukt i flere kapasiteter for å vurdere cellemigrering og proliferasjon under forskjellige eksperimentelle betingelser ^5. Analysen innebærer utsåing de utpekte celler, dyrke dem til å fullføre eller nær konfluens, og skrape den resulterende monolaget med en steril nål eller pipettespiss ^6. Analysen er oftest utført ved å sammenligne bredden av bunnen i løpet av flere tidspunkter på tilfeldig valgte steder ^7-9. Til tross for sin fremtredende bruk blir skrape analysen forvirret av problemer med reproduserbarhet og kvantifisering. Variasjon igenerering av bunnen ikke bare endrer mikromiljøet av cellene, men kan også hindre cellemigrasjon ved å skade platens overflate og det underliggende ekstracellulære ^matriks-5. Analyser blir ofte utført i løpet av 7 til 12 timer, men for cellelinjer som viser langsommere migrasjon og lengre analysetider, blir proliferasjon en forvirrende variabel ^7,10. Til slutt kan senescent celler generert av skrape prosessen slipper faktorer som forstyrrer den ekstracellulære signal nødvendig å lukke gapet i monolaget ^en. Optimalisering av skrape assay krever at det opprettes en jevn gap som ikke interfererer med overflateegenskaper, minimerer assay tidslengde, og som forhindrer uønsket celledød under manipulasjon. Stopperen baserte analysen er en optimering av en celle utelukkelse sone assay. Denne analysen benytter en stopper plassert i midten av brønnen som ekskluderer cellevekst, men gjør det mulig for cellene å bli belagt rundt den sentrale utelukkelse sone.For å vurdere migrasjon, blir proppen fjernes, og den resulterende utelukkelse sone tilveiebringer en overflate for migrering til å oppstå. Imidlertid er denne analysen vanskelig å tilpasse eller tilpasse ^10, og for noen anvendelser, kan denne teknikken også være kostnads ​​prohibitive.

I motsetning til skrape assays og deres derivater, trans-brønns migrasjon assays (eller Boyden kammer assays) vurdere migrering ved å kvantifisere antallet celler som beveger seg fra et kammer, gjennom en mikroporøs filtermembran, inn i et kammer som inneholder kjemotaktiske midler ^{8,11, 12.} Denne teknikk har begrenset nytte for adherente celler som MSCer fordi etter migrasjon gjennom den porøse membranen, celler holder seg til den membransiden utsatt for de kjemotaktiske midler, og kan være vanskelig å nøyaktig kvantifisere. Mens analysen er i stand til å undersøke noen tredimensjonale vandringsmønster, de begrensede celletyper som det er i stand til å nøyaktig tallfeste celle migrasjonsgrensen sin nytte ¹⁰. Et annet alternativ til skrape analyser benytter en mikro søyle matrise, som måler celle motilitet gjennom en tre-dimensjonale rommet ved hjelp av evnen til cellene for å deformere og migrere inn i matrisen som et surrogat. Polydimethlysiloxane (PDMS) elastomerer herdet over en nøyaktig form og behandlet med ozon og fibronektin frembringer et homogent og ikke-nedbrytbare mikromiljøet. Mikro pilaren avstanden kan også varieres etter behov for å måle evnen til cellene til å gå inn i matrisen ^4. Formen er skapt gjennom dypreaktiv ioneetsing av silisiumskiver for å skape en negativ versjon av høyt aspektforhold-matrise ^13. Mens analysen styrkes ved sin customizability, evne til å modellere tredimensjonal migrasjon, og analyse gjennom direkte visualisering av trekkende celler, vanskeligheter med å skape mikro-pilaren arrays økonomisk vanskelig sin omfattende bruk.

Den optimaliserte scratch analysen beskrevet i denne protokollen gir en effektiv, cost-effektiv fremgangsmåte for å produsere konsistente riper som kan analyseres ved hjelp av fritt tilgjengelig programvare. I stedet for enkle målinger bredde gjort over bunnen før og etter cellevandring, gjør at programvaren brukeren å bestemme de totale skrape områder før og etter migrasjon. Dette avansement begrenser problemet med å prøve å finne ut hvor scratch målinger bredde bør tas, og om bredden på scratch er uniform langs den lengden. I tillegg er imidlertid optimalisering av antall celler, celle konfluens og typen og graden av skade påført cellene behandlet for å optimalisere analysen ytterligere.

Protocol

Merk: For denne studien, lunge mesenchymale stromaceller (LR-MSC) fra distal lungevev ble isolert enten basert på deres uttrykk av celleoverflatemarkører (CD45 neg, CD31 neg, Sca-en høy, EpCAM neg) 14,15, ved hjelp eksplantat out-vekst 16, eller ved hjelp av enzymatisk fordøyelse 17. Adherente LR-MSC ble dyrket i DMEM med høyt glukose og ikke glutamin, 15% FBS, 1x antibiotisk / antimykotisk, og 2 mM glutamin (heretter komplett medium) og inkubert ved…

Representative Results

De skrape analysene som presenteres her ble utført ved hjelp av muselunge bosatt mesenchymale stromaceller (LR-MSC) og isolert som referert i protokollen notater. LR-MSC ble sådd ut ved en tetthet på 500.000 celler i en 60 mm vevskulturskål og dyrket til 90% konfluens i 48 timer. For å generere skade, ble 4% CSE (beskrevet ovenfor) inkubert med cellene i 24 timer etter den initielle perioden seeding men før bunnen analysen. For hver analyse ble scratch generert ved hjelp av en 200 ul pipettespiss. Innledende bilde…

Discussion

Protokollen er beskrevet her gir et kvantitativt robust, standardisert metode for å utføre og analysere skrape analyser. Enkle skrape analyser blir rutinemessig brukt i mange ulike studieretninger for å undersøke cellemigrasjon. Men tradisjonelt scratch analysen har manglet et standardisert oppsett og kvantifisering protokollen, noe som har ført til problemer med reproduserbarhet ^7,10. Mange av de endringer og optimaliseringer for å forbedre scratch analysen har redusert disse problemene, inkludert enke…

Materials

DMEM (high glucose, no added glutamine)	Life Technologies	31053-036
Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SH3091002
Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SV3007901
Glutamine, 200mM, Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SH3003401
TypeLE cell dissociation reagent	Life Technologies	12563-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SH3002802
Falcon standard 60mm tissue culture dishes	Fisher Scientific	08-772B
Fisherbrand Sterile 200ul pipet tips	Fisher Scientific	02-707-502
Inverted light microscope with camera attachment	Variable
ImageJ software	http://imagej.nih.gov/ij/
MRI_Wound_Healting plugin	http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool
Statistical analysis software	Microsoft Excel