The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.
Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.
Cellemigrering er koordinert og meget viktig for mange fysiologiske prosesser slik som vev utvikling, reparasjon og regenerasjon samt patologiske prosesser slik som cancer metastase og arteriosklerose 1. En forståelse av cellemigrasjon er særlig relevant for nye behandlingsformer som brukes til å reparere skadet vev og behandle patologiske tilstander, inkludert celletransplantasjon teknologier og kunstig vev pode 2. Gitt den nåværende interesse i rollen mesenchymale stromaceller (MSC) i formidling vev reparasjon 3, kvantifisere den vandrende kapasitet på disse cellene ved hjelp av en metode som er strengt kvantifiserbare, tilpasningsdyktig, og kostnadseffektiv er av interesse. Viktigere, må en slik analyse er tilstrekkelig følsomt til å detektere forholdsvis små endringer i cellulær trekkende kapasitet etter skade. Dagens metoder for å kvantifisere cellemigrasjon, inkludert skrape analyser, trans-brønners migrasjonsanalyser (Boyden chAmbers), micropillar arrays og celle eksklusjon sonen analyser har en rekke begrensninger i reproduserbarhet, skreddersy, kvantifisering og kostnadseffektivitet 1,4,5. Den optimaliserte scratch analysen beskrevet her demonstrerer robuste resultater, kvantifiserbare og bildebaserte analysemuligheter, kostnadseffektivitet og tilpasning til andre programmer.
Skrape-analyser er blitt brukt i flere kapasiteter for å vurdere cellemigrering og proliferasjon under forskjellige eksperimentelle betingelser 5. Analysen innebærer utsåing de utpekte celler, dyrke dem til å fullføre eller nær konfluens, og skrape den resulterende monolaget med en steril nål eller pipettespiss 6. Analysen er oftest utført ved å sammenligne bredden av bunnen i løpet av flere tidspunkter på tilfeldig valgte steder 7-9. Til tross for sin fremtredende bruk blir skrape analysen forvirret av problemer med reproduserbarhet og kvantifisering. Variasjon igenerering av bunnen ikke bare endrer mikromiljøet av cellene, men kan også hindre cellemigrasjon ved å skade platens overflate og det underliggende ekstracellulære matriks-5. Analyser blir ofte utført i løpet av 7 til 12 timer, men for cellelinjer som viser langsommere migrasjon og lengre analysetider, blir proliferasjon en forvirrende variabel 7,10. Til slutt kan senescent celler generert av skrape prosessen slipper faktorer som forstyrrer den ekstracellulære signal nødvendig å lukke gapet i monolaget en. Optimalisering av skrape assay krever at det opprettes en jevn gap som ikke interfererer med overflateegenskaper, minimerer assay tidslengde, og som forhindrer uønsket celledød under manipulasjon. Stopperen baserte analysen er en optimering av en celle utelukkelse sone assay. Denne analysen benytter en stopper plassert i midten av brønnen som ekskluderer cellevekst, men gjør det mulig for cellene å bli belagt rundt den sentrale utelukkelse sone.For å vurdere migrasjon, blir proppen fjernes, og den resulterende utelukkelse sone tilveiebringer en overflate for migrering til å oppstå. Imidlertid er denne analysen vanskelig å tilpasse eller tilpasse 10, og for noen anvendelser, kan denne teknikken også være kostnads prohibitive.
I motsetning til skrape assays og deres derivater, trans-brønns migrasjon assays (eller Boyden kammer assays) vurdere migrering ved å kvantifisere antallet celler som beveger seg fra et kammer, gjennom en mikroporøs filtermembran, inn i et kammer som inneholder kjemotaktiske midler 8,11, 12. Denne teknikk har begrenset nytte for adherente celler som MSCer fordi etter migrasjon gjennom den porøse membranen, celler holder seg til den membransiden utsatt for de kjemotaktiske midler, og kan være vanskelig å nøyaktig kvantifisere. Mens analysen er i stand til å undersøke noen tredimensjonale vandringsmønster, de begrensede celletyper som det er i stand til å nøyaktig tallfeste celle migrasjonsgrensen sin nytte 10. Et annet alternativ til skrape analyser benytter en mikro søyle matrise, som måler celle motilitet gjennom en tre-dimensjonale rommet ved hjelp av evnen til cellene for å deformere og migrere inn i matrisen som et surrogat. Polydimethlysiloxane (PDMS) elastomerer herdet over en nøyaktig form og behandlet med ozon og fibronektin frembringer et homogent og ikke-nedbrytbare mikromiljøet. Mikro pilaren avstanden kan også varieres etter behov for å måle evnen til cellene til å gå inn i matrisen 4. Formen er skapt gjennom dypreaktiv ioneetsing av silisiumskiver for å skape en negativ versjon av høyt aspektforhold-matrise 13. Mens analysen styrkes ved sin customizability, evne til å modellere tredimensjonal migrasjon, og analyse gjennom direkte visualisering av trekkende celler, vanskeligheter med å skape mikro-pilaren arrays økonomisk vanskelig sin omfattende bruk.
Den optimaliserte scratch analysen beskrevet i denne protokollen gir en effektiv, cost-effektiv fremgangsmåte for å produsere konsistente riper som kan analyseres ved hjelp av fritt tilgjengelig programvare. I stedet for enkle målinger bredde gjort over bunnen før og etter cellevandring, gjør at programvaren brukeren å bestemme de totale skrape områder før og etter migrasjon. Dette avansement begrenser problemet med å prøve å finne ut hvor scratch målinger bredde bør tas, og om bredden på scratch er uniform langs den lengden. I tillegg er imidlertid optimalisering av antall celler, celle konfluens og typen og graden av skade påført cellene behandlet for å optimalisere analysen ytterligere.
Protokollen er beskrevet her gir et kvantitativt robust, standardisert metode for å utføre og analysere skrape analyser. Enkle skrape analyser blir rutinemessig brukt i mange ulike studieretninger for å undersøke cellemigrasjon. Men tradisjonelt scratch analysen har manglet et standardisert oppsett og kvantifisering protokollen, noe som har ført til problemer med reproduserbarhet 7,10. Mange av de endringer og optimaliseringer for å forbedre scratch analysen har redusert disse problemene, inkludert enke…
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the other members of the lab for their technical assistance in developing the CSE damage assay, and their support and advice during the development of this assay. In addition, we are grateful to the Holy Cross Fenwick Scholar Committee for their support of Nicholas Cormier, and the Holy Cross College Honors program for their support of Alexander Yeo.
DMEM (high glucose, no added glutamine) | Life Technologies | 31053-036 | |
Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3091002 | |
Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SV3007901 | |
Glutamine, 200mM, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3003401 | |
TypeLE cell dissociation reagent | Life Technologies | 12563-01 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3002802 | |
Falcon standard 60mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772B | |
Fisherbrand Sterile 200ul pipet tips | Fisher Scientific | 02-707-502 | |
Inverted light microscope with camera attachment | Variable | ||
ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
MRI_Wound_Healting plugin | http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool | ||
Statistical analysis software | Microsoft Excel |