Optimisation du dosage Blessure Scratch pour détecter les changements dans murin mésenchymateuses stromales migration cellulaire Après Dommages par Soluble Extrait Cigarette Smoke
Summary
The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.
Abstract
Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.
Introduction
La migration cellulaire est hautement coordonnée et essentielle pour de nombreux processus physiologiques tels que le développement des tissus, la réparation et la régénération, ainsi que des processus pathologiques tels que les métastases du cancer et une artériosclérose. Une bonne compréhension de la migration cellulaire est particulièrement pertinent pour les nouvelles thérapies utilisées pour réparer les tissus endommagés et traiter des conditions pathologiques, y compris les technologies de transplantation de cellules et de tissus artificiels greffage 2. Compte tenu de l'intérêt actuel pour le rôle des cellules souches mésenchymateuses (CSM) dans la médiation de la réparation des tissus 3, la quantification de la capacité de migration de ces cellules en utilisant un dosage qui est rigoureusement quantifiables, adaptable et rentable est d'intérêt. Surtout, un tel essai doit être suffisamment sensible pour détecter des changements relativement subtiles dans la capacité migratoire cellulaire après les dommages. Les méthodes actuelles pour quantifier la migration des cellules, y compris des essais à gratter, des essais de migration trans-puits (Boyden chambres), tableaux micropilier et l'exclusion de la zone cellulaire tests possèdent une gamme de limitations dans la reproductibilité, de personnalisation, de quantification et coût-efficacité 1,4,5. Le dosage de zéro optimisé décrit ici démontre des résultats robustes, des capacités d'analyse et quantifiables basés sur l'image, coût-efficacité, l'adaptabilité et à d'autres applications.
Des dosages de grattage ont été utilisés dans de multiples capacités d'évaluer la migration et la prolifération cellulaire dans différentes conditions expérimentales 5. Le test implique l'ensemencement des cellules désignées, les cultiver à compléter ou à proximité de la confluence, et gratter la monocouche résultant avec une aiguille stérile ou pipette 6. L'analyse est le plus souvent réalisée en comparant la largeur de la rayure sur plusieurs points de temps à des endroits choisis au hasard 7-9. En dépit de son utilisation importante, l'essai de rayure est confondu par des problèmes avec la reproductibilité et la quantification. La variabilité dansgénération de la rayure ne modifie pas le micro-environnement des cellules, mais peut également empêcher la migration des cellules en endommageant la surface de la plaque sous-jacente et la matrice extracellulaire-5. Les dosages sont effectués fréquemment plus de 7 à 12 heures, mais pour des lignées cellulaires présentant migration plus lente et de plus longs temps de dosage, la prolifération devient un facteur de confusion 7,10. Enfin, les cellules sénescentes générés par le processus de grattage peuvent libérer des facteurs qui interfèrent avec la signalisation extracellulaire nécessaire pour combler l'écart dans la monocouche 1. Optimiser le dosage de zéro nécessite la création d'un espace cohérent qui ne perturbe pas les propriétés de surface, ce qui minimise dosage longueur de temps, et de prévenir la mort des cellules non désirées lors de la manipulation. Le dosage est basé bouchon une optimisation du dosage d'une zone d'exclusion de cellules. Cet essai utilise un bouchon placé au milieu du puits, qui exclut la croissance des cellules, mais permet aux cellules d'être plaqués autour de la zone d'exclusion central.Pour évaluer la migration, le bouchon est enlevé, et la zone d'exclusion résultante fournit une surface pour la migration se produise. Toutefois, ce dosage est difficile pour personnaliser ou adapter 10 et pour certaines applications, cette technique peut également être prohibitif.
Contrairement aux tests de grattage et de leurs dérivés, des tests de migration trans-de puits (ou de Boyden dosages de chambre) évaluer la migration en quantifiant le nombre de cellules qui se déplacent d'une chambre, à travers une membrane de filtration microporeuse, dans une chambre contenant des agents chimiotactiques 8,11, 12. Cette technique a une utilité limitée pour les cellules adhérentes comme MSC, car après la migration à travers la membrane poreuse, les cellules adhèrent au côté de la membrane exposée aux agents chimiotactiques, et peuvent être difficiles à quantifier avec précision. Alors que le test est en mesure d'examiner certains schémas de migration en trois dimensions, les types de cellules restreintes pour lesquelles il est en mesure de quantifier avec précision la limite de la migration des cellules de son utilitaire 10. Une autre alternative pour des essais de rayure utilise une matrice de micro-colonne, qui mesure la motilité cellulaire à travers un espace à trois dimensions en utilisant la capacité des cellules à se déformer et à migrer dans la matrice en tant que substitut. Polydimethlysiloxane (PDMS) élastomères durcis sur un moule précis et traités avec de l'ozone et de la fibronectine produit un micro-environnement homogène et non dégradable. Micro-pilier espacement peut également être modifié selon les besoins pour évaluer la capacité des cellules pour entrer dans le tableau 4. Le moule est créée par profonde gravure ionique réactive de plaquettes de silicium pour créer une version négative de la haute rapport d'aspect 13 gamme. Bien que le dosage est renforcé par sa personnalisation, la capacité de modéliser la migration en trois dimensions, et l'analyse par la visualisation directe des cellules migrantes, la difficulté à créer des réseaux de micro-pilier économique empêche son utilisation généralisée.
Le dosage de zéro optimisé décrit dans ce protocole offre une efficacité, des cosProcédé de t-efficace pour produire des rayures uniformes qui peuvent être analysées en utilisant un logiciel disponible gratuitement. Au lieu de simples mesures de largeur faites à travers le scratch avant et après la migration cellulaire, le logiciel permet à l'utilisateur de déterminer les zones à gratter totaux avant et après la migration. Cet avancement limite la question d'essayer de déterminer où le zéro les mesures de largeur doivent être prises, et si la largeur de la rayure est uniforme le long de sa longueur. En outre, une optimisation soignée du nombre de cellules, la confluence des cellules et le type et le degré de dommages infligés aux cellules est discutée afin d'optimiser le dosage.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici offre une méthode quantitative robuste standardisée pour réaliser et analyser les tests de grattage. Dosages à gratter simples sont couramment utilisés dans de nombreux domaines d'étude pour examiner la migration cellulaire. Cependant, traditionnellement le dosage de zéro a manqué un set-up et la quantification protocole standardisé, qui a conduit à des problèmes avec la reproductibilité 7,10. Beaucoup de modifications et optimisations pour améliorer le dosage de zér…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the other members of the lab for their technical assistance in developing the CSE damage assay, and their support and advice during the development of this assay. In addition, we are grateful to the Holy Cross Fenwick Scholar Committee for their support of Nicholas Cormier, and the Holy Cross College Honors program for their support of Alexander Yeo.
Materials
| DMEM (high glucose, no added glutamine) | Life Technologies | 31053-036 | |
| Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3091002 | |
| Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SV3007901 | |
| Glutamine, 200mM, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| TypeLE cell dissociation reagent | Life Technologies | 12563-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Falcon standard 60mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772B | |
| Fisherbrand Sterile 200ul pipet tips | Fisher Scientific | 02-707-502 | |
| Inverted light microscope with camera attachment | Variable | ||
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| MRI_Wound_Healting plugin | http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool | ||
| Statistical analysis software | Microsoft Excel |
References
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