상처 스크래치 분석의 최적화 가용성 담배 연기 추출물에 의한 손상 후 쥐 중간 엽 기질 세포 이동의 변화를 감지 할
Summary
The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.
Abstract
Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.
Introduction
세포 이동은 조직 개발, 수리 및 재생뿐만 아니라, 암의 전이 및 동맥 경화 1과 병리학 적 과정 등 많은 생리 학적 과정에 매우 조정 및 중요합니다. 세포 이동의 이해는 손상된 조직을 복구하고 세포 이식 기술과 인공 조직 2 접목을 포함한 병리학 적 조건을 치료하는 데 사용 신흥 치료에 특히 관련이있다. , 조직 복구 3을 매개 엄격 정량화 적응 및 경제적 인 관심의 분석을 이용하여 이들 세포의 이주 능력을 정량화 간엽 기질 세포 (MSC들)의 역할에 관심을 주어 현재. 중요한 것은, 이러한 분석은 손상 후 세포의 철새 용량 상대적으로 미묘한 변화를 감지 할 수있을만큼 충분히 민감해야합니다. 스크래치 분석, 트랜스 웰 마이그레이션 분석을, 세포 이동을 정량화 포함한 현재의 방법 (보이든의 채널ambers) micropillar 어레이 및 셀 배제 영역 분석법은 재현성, 커스터마이즈, 정량화 및 경제성 1,4,5 한계의 범위를 갖는다. 여기에 설명 된 최적화 된 스크래치 분석은 강력한 결과, 정량화 및 이미지 기반 분석 기능, 비용 효율성 및 기타 응용 프로그램에 대한 적응성을 보여줍니다.
스크래치 분석은 다른 실험 조건 하에서 5 세포 이동과 증식을 평가하기 위해 여러 용량으로 사용되어왔다. 분석은 또는 가까운 합류를 완료하기 위해 그들을 성장, 지정된 세포를 파종하고, 멸균 바늘 또는 피펫 팁 6 결과 단층를 긁적 수반한다. 분석은 가장 일반적으로 무작위로 위치 7-9에서 여러 시간 지점 위에 스크래치의 폭을 비교함으로써 수행된다. 그것의 저명한 사용에도 불구하고, 스크래치 분석은 재현성과 정량 문제에 의해 혼동된다. 의 변동성흠집의 발생뿐만 아니라, 세포의 미세 환경을 변화뿐만 아니라, 플레이트 표면과 기저 세포 외 매트릭스 (5)의 손상에 의해 세포 이동을 저해 할 수있다. 분석법 빈번 그러나 느린 이동 및 더 긴 분석 시간을 표시하는 세포주에 대해, 12 시간에 걸쳐 진행되는 7, 증식 교란 변수 7,10된다. 마지막으로, 찰과 공정에 의해 생성 된 노화 세포는 단층 1 격차를하는데 필요한 세포 외 신호에 방해 요인을 해제 할 수있다. 스크래치 시험을 최적화하면 분석 시간 길이를 최소화하고, 조작 동안 원치 않는 세포 사멸을 방지하는 표면 특성을 방해하지 않는 일관 갭의 생성을 필요로한다. 스토퍼 기재 분석법은 세포 배제 영역 분석법의 최적화이다. 이 분석은 세포 성장을 배제 웰의 중앙에 배치 된 스토퍼를 이용하지만, 세포가 배제 중앙 영역의 주위에 도금 될 수있다.마이그레이션을 평가하기 위해, 스토퍼가 제거되며, 생성 된 배타 존은 마이그레이션이 발생하기위한 표면을 제공한다. 그러나 이러한 분석은 사용자 또는 10 적응 어렵고 일부 애플리케이션의 경우,이 기술은 엄청난 비용이 될 수있다.
스크래치 시험 법 및 이들의 유도체, 트랜스 웰 마이그레이션 분석 (또는 보이든 챔버 분석법) 대조적 화성 제 8,11 함유 챔버에, 미 공성 여과막을 통해, 하나의 챔버로부터 이동 세포 수를 정량함으로써 마이그레이션을 평가 (12). 다공성 막을 통한 마이그레이션 다음, 세포가 주 화성 제제에 노출 막 측에 부착하고 정확하게 정량화하기 어려울 수 있기 때문에 이러한 기술은 중간 엽 줄기 세포에 대한 부착 성 등 유틸리티를 한정 하였다. 분석은 어떤 입체 이주 패턴을 검사 할 수 있지만, 제한된 세포 유형은 그것을 정확하게 세포 이동 한계는 유틸리티를 정량화 할 수있다 (10). 스크래치 시험 법에 대한 다른 대안은 변형 및 대리 배열에 마이그레이션하는 세포의 능력을 이용하여 3 차원 공간을 통해 세포 운동성을 측정 마이크로 필러 배열을 사용한다. Polydimethlysiloxane (PDMS) 엘라스토머는 정밀 몰드 위에 경화와 오존으로 처리하고 피브로넥틴이 균일 및 비 분해성 미세 환경을 생성한다. 어레이 (4)를 입력하는 세포의 능력을 측정하기 위해 필요에 따라 마이크로 필러 간격 또한 변경 될 수있다. 주형은 높은 종횡비의 어레이 (13)의 음의 버전을 생성하도록 실리콘 웨이퍼의 깊은 반응성 이온 에칭을 통해 생성된다. 그 분석은 커스터마이즈에 의해 강화되지만, 이주 능력 세포 직접적인 시각화를 통해 입체 마이그레이션 및 분석을 모델링하는, 마이크로 필러 어레이를 생성하는데 어려움이 경제적으로 널리 사용을 방해한다.
이 프로토콜에 설명 된 최적화 스크래치 분석은 효율적 COS를 제공자유롭게 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 분석 될 수 일관된 흠집 제조 t 효율적인 방법. 대신 전 세포 이동 후 스크래치 걸쳐 만든 단순한 폭 측정, 소프트웨어는 마이그레이션 전과 후의 총 스크래치 영역을 결정하기 위해 사용자를 가능하게한다. 이 진보가 여기서 폭 측정들이 취해 져야한다 스크래치 판단하려고하는 문제를 제한하고, 스크래치의 폭의 여부의 길이를 따라 균일하다. 또한, 세포 수, 세포 유형과 합류하고 세포에 가해진 손상의 정도는 더욱 신중한 최적화 분석을 최적화하기 위해 논의된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 프로토콜을 수행하고 스크래치 시험 법을 정량적으로 분석 할 수있는 견고하고 표준화 된 방법을 제공한다. 간단한 스크래치 분석은 정기적으로 세포의 이동을 조사하는 연구의 다양한 분야에서 사용된다. 그러나 전통적으로 스크래치 분석은 재현성 7,10에 문제하게되었다 표준화 된 설정 및 정량 프로토콜을 결여하고있다. 변형 및 스크래치 시험을 향상 최적화 많은 개?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the other members of the lab for their technical assistance in developing the CSE damage assay, and their support and advice during the development of this assay. In addition, we are grateful to the Holy Cross Fenwick Scholar Committee for their support of Nicholas Cormier, and the Holy Cross College Honors program for their support of Alexander Yeo.
Materials
| DMEM (high glucose, no added glutamine) | Life Technologies | 31053-036 | |
| Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3091002 | |
| Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SV3007901 | |
| Glutamine, 200mM, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| TypeLE cell dissociation reagent | Life Technologies | 12563-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Falcon standard 60mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772B | |
| Fisherbrand Sterile 200ul pipet tips | Fisher Scientific | 02-707-502 | |
| Inverted light microscope with camera attachment | Variable | ||
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| MRI_Wound_Healting plugin | http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool | ||
| Statistical analysis software | Microsoft Excel |
References
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