אופטימיזציה של assay Scratch הפצע כדי לזהות שינויים בנדידת תאי Murine mesenchymal סטרומה לאחר נזק על ידי תמצית עשן סיגריות מסיס
Summary
The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.
Abstract
Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.
Introduction
נדידת תאים היא מתואמת ביותר וחיונית לתהליכים פיסיולוגיים רבים כגון פיתוח רקמות, תיקון, והתחדשות, כמו גם תהליכים פתולוגיים כגון גרורות סרטן וטרשת עורקת 1. הבנה של נדידת תאים רלוונטית במיוחד לטיפולים מתעוררים משמשים לתיקון רקמות פגועות וטיפול במצבים פתולוגיים, כולל טכנולוגיות השתלת תאים ורקמות מלאכותיות השתלת 2. לאור ההתעניינות הנוכחית בתפקיד של תאי סטרומה mesenchymal (MSCs) בתיווך רקמת תיקון 3, כימות יכולת הנדידה של תאים אלה באמצעות assay שהוא בקפדנות לכימות, להתאמה, והוא עניין חסכוני. חשוב לציין, assay כזה חייב להיות רגיש מספיק כדי לזהות שינויים עדינים יחסית ביכולת נדידה סלולרית לאחר נזק. שיטות קיימים לכימותי נדידת תאים, כולל מבחני מאפס, מבחני הגירת טרנס היטב (CH וידןambers), מערכי micropillar, ומבחני אזור הדרת תא יש מגוון של מגבלות בשחזור, ההתאמה האישית, כימות, ועלות-תועלת 1,4,5. Assay השריטה מותאמת המתואר כאן מדגים תוצאות חזקות, יכולות ניתוח וכימות מבוסס תמונה, עלות-תועלת, והתאמה ליישומים אחרים.
מבחני גירוד שימשו בתפקידים מרובים להעריך נדידת תאים והתרבות בתנאי ניסוי שונה 5. Assay כרוך זריעת התאים הייעודיים, גידולם כדי להשלים או מפגש קרוב, ומגרד את monolayer התוצאה עם מחט סטרילית או קצה pipet 6. ניתוח מבוצע בדרך כלל על ידי השוואת הרוחב של השריטה על נקודות זמן מרובות במקומות שנבחרו באקראי 7-9. למרות השימוש הבולט שלה, assay השריטה הוא מבולבל על ידי בעיות עם שחזור וכימות. השתנות בדור של השריטה לא רק משנה את המיקרו-הסביבה של התאים, אבל גם יכול לעכב נדידת תאים על ידי פגיעה במשטח הצלחת ותאית-מטריצה בסיסית 5. מבחני נערכים בתדירות גבוהה מעל 7 לשעה 12, לעומת זאת לשורות תאים בו מוצגות הגירה ופעמים assay יותר איטיות, ריבוי הופך 7,10 משתנים בלבול. לבסוף, תאים מזדקנים שנוצרו על ידי תהליך הגירוד יכולים לשחרר גורמים שמפריעים לאיתות תאית הדרושה כדי לסגור את הפער בשכבה 1. אופטימיזציה של assay מאפס דורשת יצירת פער עקבי שאינו מפריע למאפייני שטח, מזעור אורך זמן assay, ומניעת מוות של תאים לא רצוי במניפולציה. Assay מבוסס פקק הוא אופטימיזציה של assay אזור הדרת תא. assay זה מנצל פקק ממוקם באמצע גם שאינה כולל צמיחת תאים, אבל מאפשר לתאים להיות מצופים ברחבי אזור ההדרה המרכזי.כדי להעריך הגירה, הפקק מוסר, ואזור הדרת התוצאה מספק משטח להגירה להתרחש. עם זאת, assay זה קשה כדי להתאים אישית או להתאים 10 ועבור יישומים מסוימים, טכניקה זו יכולה גם להיות עלות מונעת.
בניגוד למבחנים מאפס ונגזרותיהם, מבחני הגירת טרנס היטב (או מבחני קאמריים בוידן) להעריך הגירה על ידי כימות את מספר התאים שעוברים מתא אחד, דרך קרום מסנן microporous, לתא המכיל סוכני chemotactic 8,11, 12. טכניקה זו מוגבלת שירות עבור תאים חסיד כמו MSCs כי בעקבות הגירה דרך הקרום הנקבובי, תאים לדבוק בצד הקרום נחשף לסוכני chemotactic, ויכולים להיות קשה לכמת במדויק. בעוד assay הוא מסוגל לבחון כמה דפוסי הגירה תלת-ממדיים, סוגים המוגבלים התא שהוא מסוגל לכמת מגבלת נדידת תאי השירות שלה בצורה מדויקת 10. חלופה נוספת למבחני שריטה משתמשת מערך מיקרו-עמוד, אשר מודד תנועתיות סלולרית דרך מרחב תלת-ממדים באמצעות היכולת של תאים כדי לעוות ולהעביר לתוך המערך כפונדקאי. Polydimethlysiloxane אלסטומרים (PDMS) נרפאו על עובש מדויק וטופלו באוזון ופיברונקטין מייצר מייקרו-סביבה הומוגנית ואינו מתכלה. מרווח מיקרו-עמוד גם יכול להיות מגוון לפי צורך לאמוד את יכולתם של תאים להיכנס למערך 4. העובש נוצר באמצעות תחריט יון תגובה עמוק של פרוסות סיליקון כדי ליצור גרסה שלילית של מערך יחס רוחב-גובה הגבוה 13. בעוד assay מתחזק על ידי ההתאמה האישית שלה, היכולת לבנות מודל תלת ממדי הגירה, וניתוח באמצעות הדמיה ישירה של תאים נודדים, קושי ביצירת מערכי מיקרו-כלכלי עמוד מעכב השימוש הנרחב שלה.
Assay השריטה מותאמת מתואר בפרוטוקול זה מספק יעיל, cosשיטה לא יעילים להפקת סריטות עקביות שניתן לנתח באמצעות תוכנה זמינה באופן חופשי. במקום מדידות רוחב פשוט עשו על פני השריטה לפני ואחרי נדידת תאים, התוכנה מאפשרת למשתמש לקבוע כלל אזורי מאפס לפני ואחרי ההגירה. קידום זה מגביל את סוגיית מנסה לקבוע היכן השריטה צריכה לקחת מדידות הרוחב, ואם הרוחב של השריטה הוא אחיד לכל אורכו של. בנוסף, אופטימיזציה זהירה של מספרים סלולריים, מפגש תא ואת הסוג ומידת הנזק שנגרם לתאים נדונה על מנת לייעל את assay נוסף.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטת כמותית חזקה, תקנית לבצע ולנתח מבחני מאפס. מבחני שריטה פשוטים משמשים באופן שיגרתי בתחומים רבים ושונים של מחקר לבחון הגירה סלולרית. עם זאת, באופן מסורתי assay השריטה חסר פרוטוקול הגדרה וכימות סטנדרטי, מה שהוביל לבעיות בשחזור 7,10. רבים מ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the other members of the lab for their technical assistance in developing the CSE damage assay, and their support and advice during the development of this assay. In addition, we are grateful to the Holy Cross Fenwick Scholar Committee for their support of Nicholas Cormier, and the Holy Cross College Honors program for their support of Alexander Yeo.
Materials
| DMEM (high glucose, no added glutamine) | Life Technologies | 31053-036 | |
| Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3091002 | |
| Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SV3007901 | |
| Glutamine, 200mM, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| TypeLE cell dissociation reagent | Life Technologies | 12563-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Falcon standard 60mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772B | |
| Fisherbrand Sterile 200ul pipet tips | Fisher Scientific | 02-707-502 | |
| Inverted light microscope with camera attachment | Variable | ||
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| MRI_Wound_Healting plugin | http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool | ||
| Statistical analysis software | Microsoft Excel |
References
- Gough, W., Hulkower, K. I., Lynch, R., et al. A quantitative, facile, and high-throughput image-based cell migration method is a robust alternative to the scratch assay. J. Biomol. Screen. 16 (2), 155-163 (2011).
- Ridley, A. J., Schwartz, M. A., Burridge, K., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2013).
- Sharma, R. R., Pollock, K., Hubel, A., McKenna, D. Mesenchymal stem or stromal cells: a review of clinical applications and manufacturing practices. Transfusion. 54 (5), 1418-1437 (2014).
- Booth-Gauthier, E. A., Du, V., Ghibaudo, M., et al. Hutchinson-Gilford progeria syndrome alters nuclear shape and reduces cell motility in three dimensional model substrates. Integr. Biol. (Camb). 5 (3), 569-577 (2013).
- Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. Electrical wound-healing assay for cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (6), 1554-1559 (2004).
- Pinco, K. A., He, W., Yang, J. T. Alpha4beta1 Integrin Regulates Lamellipodia Protrusion Via a Focal Complex/focal Adhesion-Independent Mechanism. Mol. Biol. Cell. 13 (9), 3203-3217 (2002).
- Fronza, M., Heinzmann, B., Hamburger, M., Laufer, S., Merfort, I. Determination of the wound healing effect of Calendula extracts using the scratch assay with 3T3 fibroblasts. J. Ethnopharmacol. 126 (3), 463-467 (2009).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Walter, M. N., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: an in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Exp. Cell Res. 316 (7), 1271-1281 (2010).
- Goetsch, K. P., Niesler, C. U. Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis. Anal. Biochem. 411 (1), 158-160 (2011).
- Chung, C. A., Chen, C. Y. The effect of cell sedimentation on measuring chondrocyte population migration using a Boyden chamber. J. Theor. Biol. 261 (4), 610-625 (2009).
- Fabbri, M., Bianchi, E., Fumagalli, L., Pardi, R. Regulation of lymphocyte traffic by adhesion molecules. Inflamm. Res. 48 (5), 239-246 (1999).
- Saez, A., Ghibaudo, M., Buguin, A., Silberzan, P., Ladoux, B. Rigidity-driven growth and migration of epithelial cells on microstructured anisotropic substrates. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (20), 8281-8286 (2007).
- Paxson, J. A., Gruntman, A. M., Davis, A. M., et al. Age Dependence of Lung Mesenchymal Stromal Cell Dynamics Following Pneumonectomy. Stem Cells Dev. 22 (24), 3214-3225 (2013).
- McQualter, J. L., Brouard, N., Williams, B., et al. Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction. Stem Cells. 27 (3), 623-633 (2009).
- Hoffman, A. M., Paxson, J. A., Mazan, M. R., et al. Lung-Derived Mesenchymal Stromal Cell Post-Transplantation Survival, Persistence, Paracrine Expression, and Repair of Elastase-Injured Lung. Stem Cells Dev. 20 (10), 1779-1792 (2011).
- Beane, O. S., Fonseca, V. C., Cooper, L. L., Koren, G., Darling, E. M. Impact of aging on the regenerative properties of bone marrow-, muscle-, and adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells. PLoS One. 9 (12), e115963 (2014).
- Chen, L., Ge, Q., Tjin, G., et al. Effects of cigarette smoke extract on human airway smooth muscle cells in COPD. Eur. Respir. J. 44 (3), 634-646 (2014).
- Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay. Methods Mol. Biol. 371, 21-31 (2007).
