Optimización del ensayo arañazos herida para detectar cambios en Murino mesenquimales estromales migración de células después de daño por Soluble Extracto humo del cigarrillo
Summary
The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.
Abstract
Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.
Introduction
La migración celular es altamente coordinada y vital para muchos procesos fisiológicos tales como el desarrollo de tejidos, la reparación y la regeneración, así como procesos patológicos tales como la metástasis del cáncer y la arteriosclerosis 1. Una comprensión de la migración celular es particularmente relevante para las nuevas terapias utilizadas para reparar los tejidos dañados y tratar condiciones patológicas, incluidas las tecnologías de trasplante de células y tejido artificial injerto 2. Dado el interés actual en el papel de las células estromales mesenquimales (MSC) en la mediación de la reparación de tejidos 3, la cuantificación de la capacidad migratoria de estas células utilizando un ensayo que es rigurosamente cuantificables, adaptable y rentable es de interés. Es importante destacar que dicho ensayo deberá ser lo suficientemente sensible para detectar cambios relativamente sutiles en la capacidad migratoria celular después del daño. Los métodos actuales para cuantificar la migración de células, incluyendo los ensayos de cero, los ensayos de migración trans-pocillos (Boyden chámbar), matrices microcolumnas, y ensayos de la zona de exclusión de células poseen una serie de limitaciones en la reproducibilidad, personalización, cuantificación, y la rentabilidad 1,4,5. El ensayo cero optimizado descrito aquí demuestra resultados robustos, capacidades de análisis cuantificables y basados en imágenes, la rentabilidad y la capacidad de adaptación a otras aplicaciones.
Los ensayos de cero se han utilizado en múltiples capacidades para evaluar la migración y la proliferación celular en diferentes condiciones experimentales 5. El ensayo implica la siembra de las células designadas, el crecimiento de ellos para completar o cerca de confluencia, y arañar la monocapa resultante con una aguja estéril o punta de la pipeta 6. Análisis es más comúnmente lleva a cabo comparando el ancho de la cero a través de múltiples puntos de tiempo en lugares seleccionados al azar 7-9. A pesar de su uso prominente, el ensayo cero es confundida por problemas con la reproducibilidad y la cuantificación. La variabilidad engeneración del cero no sólo altera el microambiente de las células, pero también puede impedir la migración de células al dañar la superficie de la placa y la matriz extracelular subyacente 5. Los ensayos se llevan a cabo con frecuencia más de 7 a 12 horas, sin embargo, para las líneas celulares que muestran la migración más lenta y tiempos de ensayo más largos, la proliferación se convierte en una variable de confusión 7,10. Por último, las células senescentes generados por el proceso de rascado pueden liberar factores que interfieren con la señalización extracelular requerida para cerrar la brecha en la monocapa 1. Optimización del ensayo de cero requiere la creación de un vacío constante que no interfiera con las propiedades de superficie, minimizando ensayo de duración de tiempo, y la prevención de la muerte celular no deseada durante la manipulación. El ensayo basado tapón es una optimización de un ensayo de zona de exclusión celular. Este ensayo utiliza un tapón colocado en el centro del pozo que excluye el crecimiento celular, pero permite que las células se sembraron alrededor de la zona de exclusión central.Para evaluar la migración, se quita el tapón, y la zona de exclusión resultante proporciona una superficie para que se produzca la migración. Sin embargo, este ensayo es difícil personalizar o adaptar 10 y para algunas aplicaciones, esta técnica también puede tener un costo prohibitivo.
En contraste con los ensayos de cero y sus derivados, los ensayos de migración trans-bien (o ensayos de cámara de Boyden) evaluar la migración mediante la cuantificación del número de células que se mueven de una cámara, a través de una membrana de filtro microporoso, en una cámara que contiene agentes quimiotácticos 8,11, 12. Esta técnica tiene una utilidad limitada para las células adherentes como MSCs porque después de la migración a través de la membrana porosa, las células se adhieren a un lado membrana expuesta a los agentes quimiotácticos, y pueden ser difíciles de cuantificar con precisión. Mientras que el ensayo es capaz de examinar algunos patrones de migración en tres dimensiones, los tipos de células restringidas de las que es capaz de cuantificar con precisión el límite de migración celular su utilidad 10. Otra alternativa a los ensayos de cero utiliza una matriz de micro-pilar, que mide la motilidad celular a través de un espacio tridimensional utilizando la capacidad de las células para deformar y migrar en la matriz como un sustituto. Polydimethlysiloxane (PDMS) elastómeros curados sobre un molde preciso y tratados con ozono y fibronectina produce un microambiente homogénea y no degradable. Espaciamiento Micro-pilar también se puede variar como sea necesario para medir la capacidad de las células para entrar en la matriz 4. El molde se crea a través de grabado iónico reactivo profundo de obleas de silicio para crear una versión negativa de la matriz de alta relación de aspecto 13. Mientras que el ensayo se refuerza por su personalización, capacidad de modelar la migración tridimensional, y el análisis a través de la visualización directa de células que migran, dificultad en la creación de matrices de micro-pilar económicamente impide su uso generalizado.
El ensayo cero optimizado descrito en este protocolo proporciona un eficiente, cosmétodo t-efectiva para producir rasguños consistentes que pueden ser analizados utilizando el software de libre acceso. En lugar de medidas de ancho simples hechas a través del cero antes y después de la migración celular, el software permite al usuario determinar las áreas totales de arañazos antes y después de la migración. Este avance limita el problema de tratar de determinar dónde está el cero las medidas de ancho se deben tomar, y si el ancho de la cero es uniforme a lo largo de su longitud. Además, la optimización cuidadosa del número de células, la confluencia celular y el tipo y grado de daño causado a las células se discute con el fin de optimizar aún más el ensayo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí proporciona un método cuantitativo robusto, estandarizado para realizar y analizar los ensayos de cero. Los ensayos de cero simples se utilizan rutinariamente en muchas áreas diferentes de estudio para examinar la migración celular. Sin embargo, tradicionalmente el ensayo cero ha carecido de una puesta a punto y cuantificación protocolo estandarizado, lo que ha dado lugar a problemas con la reproducibilidad 7,10. Muchas de las modificaciones y optimizaciones para mejorar el ens…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the other members of the lab for their technical assistance in developing the CSE damage assay, and their support and advice during the development of this assay. In addition, we are grateful to the Holy Cross Fenwick Scholar Committee for their support of Nicholas Cormier, and the Holy Cross College Honors program for their support of Alexander Yeo.
Materials
| DMEM (high glucose, no added glutamine) | Life Technologies | 31053-036 | |
| Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3091002 | |
| Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SV3007901 | |
| Glutamine, 200mM, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| TypeLE cell dissociation reagent | Life Technologies | 12563-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Falcon standard 60mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772B | |
| Fisherbrand Sterile 200ul pipet tips | Fisher Scientific | 02-707-502 | |
| Inverted light microscope with camera attachment | Variable | ||
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| MRI_Wound_Healting plugin | http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool | ||
| Statistical analysis software | Microsoft Excel |
References
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