FACS에 의해 쥐 피부 섬유 아세포 격리
Summary
Fibroblast behavior underlies a spectrum of clinical entities, but they remain poorly characterized, largely due to their inherent heterogeneity. Traditional fibroblast research relies upon in vitro manipulation, masking in vivo fibroblast behavior. We describe a FACS-based protocol for the isolation of mouse skin fibroblasts that does not require cell culture.
Abstract
섬유 아세포는 세포 외 기질을 분비에 대한 책임 원칙 세포의 유형과 여러 장기와 조직의 중요한 구성 요소입니다. 섬유 아세포의 생리와 병리 여러 기관에서 fibroses, 비후성 흉터 다음 화상, 허혈 다음 심장 기능 상실, 암 기질의 형성을 포함하여 임상 기관의 스펙트럼을 기초. 그러나, 섬유 아 세포는 크게 인해 고유의 이질성에, 셀의 잘못 특성화 유형 남아있다. 섬유 아 세포의 분리를위한 기존의 방법은 근본적으로 세포의 표현형과 행동에 영향을 미치는 세포 배양의 시간이 필요합니다. 따라서, 섬유 아세포 생물학을 연구 많은 연구는 체외 조작에 의존하고 정확하게 생체 내에서 섬유 아세포의 동작을 캡처하지 않습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 우리는 preservi함으로써, 세포 배양을 필요로하지 않는 성인 마우스의 등쪽 피부 섬유 아세포의 분리에 대한 FACS 기반 프로토콜을 개발생리적 전사 및 각 셀의 프로테옴 프로파일을 겨. 우리의 전략은 혈통 음의 게이트를 통해이 아닌 중간 엽 계통의 배제를 허용 (린 -)가 아니라 특정 표면 마커를 발현하는 섬유 아 세포의 하위 집단의 사전 선택 또는 농축을 방지하고이 이질적인에서 가능한 한 포함 될 수있는 긍정적 인 선택 전략을보다 세포 유형.
Introduction
섬유 아세포는 자주 플라스틱 기판에 부착 스핀들 모양의 세포로 형태 학적으로 정의된다. 합성 섬유 아세포 및 배아 및 성체 기관 (1)의 세포 외 매트릭스를 리모델링을 담당 원리 세포 유형이다. 섬유 아세포는 포유류의 개발에 중요하며, 따라서 각 조직 및 기관에 존재하는 세포 유형 이웃의 동작에 영향을 미치는 세포 외 환경에 실질적으로 기여한다.
섬유 아세포는 엄청난 임상 부담의 원인이 의료 조건의 다양한 세트 뒤에 주요 세포 유형입니다. 병리학 섬유 아세포 활성은 정상 조직의 기능 손상 및 피부 상처 치유, 죽상 동맥 경화증, 전신성 경화증, 혈관 손상 2-5 후 아테롬성 플라크의 형성 다음 조직 (예 : 폐, 간 등) 장기 섬유증, 반흔을 포함한다. 특히 상처 치유, 모두 급성과 만성, D를 포함정상 조직 등에도 유사한 기능이나 그것을 둘러싼, 다양한 병리학 적 상태에 걸쳐 상당한 이환율을 초래 흉터 조직의 eposition. 손상 후,이어서, 구조적 ECM 성분을 분비하는 세포 유형에 인접한 주변 분비 효과를 발휘하고, 흉터 조직 (6)을 증착하여 기계적 안정성을 복원 근섬유 아세포로의 전환이있다.
피부 조직에서 발달 시간에 걸쳐 감겨 수리의 품질 및 해부학 적 부위 사이에 상당한 변화가 존재한다. 인생의 첫 두 학기에 태아는 흉터없이 치유; 그러나,에 성인기에 걸쳐 세 번째 임신에서, 상처와 치유 인간. 사이트 별, 연령별 이외에, 상처 치유의 차이가 존재한다. 피부의 상처 흉터 조직 내의 증착 9 상당한 동안 구강에 상처, 최소 반흔 7,8으로 개조. 논쟁은 C를 지속연령 및 위치 10, 11 모두에 관해서 상처 치유의 결과를 로컬 섬유 아세포의 고유 특성에 비해 환경의 영향을 상대적 oncerning. 피부의 진피 및 이전 배아 (E15) 대 구강 마우스의 치료에 유의 한 차이를 감안할 대 이후 배아 (E18) 진피, 그것은 특정 발달 연령에 다양한 해부학 적 부위 중 섬유 아세포의 인구에 본질적인 차이가 존재하는 것 같다 .
1986 년 해롤드 F. 드보락은 종양이 12을 치유하지 않는 상처입니다 상정. 드보락은 종양이 신체의 상처처럼 동작하고 호스트의 응답 상처 치유를 활성화시킴으로써 그들의 기질을 유도한다는 결론을 내렸다. 많은 연구 이후 암 13-15의 진행에 섬유 아 세포의 기여를 조사하지만, 한 상처 치유, 정체성과 피부 캘리포니아의 기질 구획에 기여하는 섬유 아 세포의 배아 기원의 경우와 같이rcinomas 적절하게 정의되지 않았습니다. 이 질문에 대한 대답은 항암 치료 (16)에 대한 잠재적으로 효과적인 대상으로 종양 관련 섬유 아세포를 노출 최근의 연구 주어진 의료 관련을 맺는다.
식별 및 전향 생체 폐의 섬유 전위 부여 섬유 아세포 계통을 분리하는 것은 효과적으로 급성 및 만성 질환 상태의 넓은 범위에 걸쳐 손상에 대한 반응을 조작 향해 필수적인 단계이다. 1987 년 Cormack는 유두와 망상 진피 (17, 18) 내에서 하나의 내부에있는 섬유 아세포의 두 개체군, 하나를 보여 주었다. 세 번째 모집단은 여포 (19, 20)의 모유두 지역에서 모낭과 관련된 발견되었다. 때 배양, 성장 잠재력, 형태, 및 성장 인자 / 사이토 카인 이러한 섬유 아세포 아형 전시 차이는 21 ~ 24 프로필.
현재까지, 섬유 아세포를 조사 연구 그는terogeneity 크게 적절하게 생체 내에서 섬유 아세포 중 발달 및 기능 다양성의 특성을 실패했습니다. 이것은, 부분적으로, 배양 된 섬유 아세포의 집단에 의존하고, 모든 섬유 아세포 (25)에 의해 표현되는 자기 표면 수용체의 기초 하에서 세포 배양 또는 양성 선별의 균질화 효과의 결과이다. 우리의 실험실에서 최근의 연구는 깊은 표면 마커이 원고 (26)에 제시된 FACS 기반의 분리 방법에 의해 분리 대 교양 교양 섬유 아 세포에서 전사 변화를 보여 주었다.
그 후, 우리는 쥐의 등쪽 진피 내의 특정 섬유 아세포의 계보를 파악하고 Engrailed-1의 배아 식으로 정의이 계보는,, 등의 피부의 결합 조직 증착을위한 일차적 책임이 있다고 결정했다. 상처 치유, 암 기질 형성 등을 포함 섬유증의 급성 및 만성 형태 모두 동안의 계보 기능방사선 섬유증 (27)을 유도. 별개의 섬유 아세포 계통의 특성은 폐의 섬유 성 행동을 조절하기위한 치료를위한 중요한 의미를 가지고있다.
오히려 세포 격리 28, 29을 달성하기 위해 체외 조작에 의존하는 기존의 프로토콜을 사용하는 것보다, 여기에 설명 된 수확 프로토콜 (그림 1)보다 정확하게 생체 내에서 표현형과 동작을 캡처 섬유 아 세포의 수율 정보 분석을하는 데 도움이됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문에 설명 된 프로토콜이 하위 집단을 위해 선택 또는 후속 분석하기 전에 세포 배양에서의 시간이 필요하거나 기존의 방법에 비해, FACS 기반 정렬하여 섬유 아세포를 분리하는 수단을 제공한다. 섬유 아세포의 선별을 피부로부터 채취 필요한 시간은 약 6 시간이고; 그러나, 수확에 사용 된 마우스의 수는이 추정에 영향을 미칠 것이다.
프로토콜의 몇 가지 포인트는 특?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 (HPL에) NIH 보조금 R01 GM087609, (MTL에) (HPL에) 앤서니 슈, NIH 보조금 U01의 HL099776의 명예에 잉그리드 라이 빌 슈의 선물, Hagey 실험실에서 보조금에 의해 부분적으로 지원 소아 재생 의학 및 오크 재단 (MTL에, GCG와 HPL). GGW 의학의 스탠포드 대학, 스탠포드 의료 과학자 훈련 프로그램에 의해 지원 및 NIGMS 훈련 보조금 GM07365했다. ZNM는 성형 외과 재단 연구 활동 그랜트와 Hagey 가족 기금에 의해 지원되었다. MSH는 캘리포니아 재생 의학 연구소 (CIRM) 임상 연구원 교육 교부금 TG2-01159, 악안면 외과 의사의 미국 사회 (ASMS) / 악안면 외과 재단 (MSF) 연구 그랜트 수상하고, 이식 및 조직 공학 원정대 수상에 의해 지원되었다.
Materials
| Surgical Forceps | Kent Scientific | INS650916 | |
| Micro-scissors | Kent Scientific | INS600127 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| Nair (depilatory cream) | Church and Dwight Co. | 22600267058 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Elastase | Abcam | ab95133 | |
| DMEM | Life Technologies | A14430-01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| 40 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 70 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 100 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CD31 | BioLegend | 102421 | |
| CD45 | BioLegend | 103125 | |
| Tie2 | BioLegend | 124005 | |
| Ter-119 | BioLegend | 116233 | |
| EpCAM (CD326) | eBioscience | 48-5791 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| propidium iodide (PI viability stain) | BioLegend | 421301 |
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