Murino fibroblastos dérmicos aislamiento por FACS
Summary
Fibroblast behavior underlies a spectrum of clinical entities, but they remain poorly characterized, largely due to their inherent heterogeneity. Traditional fibroblast research relies upon in vitro manipulation, masking in vivo fibroblast behavior. We describe a FACS-based protocol for the isolation of mouse skin fibroblasts that does not require cell culture.
Abstract
Los fibroblastos son el tipo de célula principio responsable de la secreción de la matriz extracelular y son un componente crítico de muchos órganos y tejidos. Fisiología y patología de fibroblastos subyacen a un espectro de entidades clínicas, incluyendo fibrosis en múltiples órganos, cicatrización hipertrófica siguientes quemaduras, pérdida de la función cardíaca después de la isquemia, y la formación de estroma cáncer. Sin embargo, los fibroblastos siguen siendo un tipo mal caracterizado de la célula, en gran parte debido a su heterogeneidad inherente. Los métodos existentes para el aislamiento de los fibroblastos requieren tiempo en el cultivo celular que influye profundamente en el fenotipo celular y el comportamiento. En consecuencia, muchos estudios de investigación de la biología de los fibroblastos se basan en la manipulación in vitro y no reflejan con precisión el comportamiento de fibroblastos in vivo. Para superar este problema, hemos desarrollado un protocolo basado en FACS para el aislamiento de fibroblastos de la piel dorsal de ratones adultos que no requiere el cultivo de células, con lo que preserving de la transcripción fisiológica y el perfil proteómico de cada celda. Nuestra estrategia permite la exclusión de linajes no mesenquimales través de una puerta negativa linaje (Lin -) en lugar de una estrategia de selección positiva para evitar la preselección o el enriquecimiento de una subpoblación de fibroblastos que expresan marcadores de superficie específicos y ser lo más inclusivo posible a través de esta heterogénea tipo de célula.
Introduction
Los fibroblastos se definen con frecuencia morfológicamente como células en forma de huso que se adhieren a sustratos de plástico. Los fibroblastos son el tipo de célula principio responsable de sintetizar y remodelación de la matriz extracelular en embrionarias y adultas órganos 1. Los fibroblastos son por lo tanto fundamental para el desarrollo de mamíferos y contribuyen sustancialmente al medio extracelular que influye en el comportamiento de la vecina tipos presentes en cada tejido y órgano de células.
Los fibroblastos son también el tipo célula principal detrás de un conjunto diverso de condiciones médicas que causan enorme carga clínica. Actividad de los fibroblastos patológica deteriora la función del tejido normal y incluye tejido y la fibrosis de órganos (tales como el pulmón y el hígado), la cicatrización después de la curación de la herida cutánea, la aterosclerosis, esclerosis sistémica, y la formación de placas de ateroma después de la lesión del vaso sanguíneo 2-5. La cicatrización de heridas, en particular, ambos, implica aguda y crónica deposition de tejido cicatrizal que ni se parece ni funciona como el tejido normal que lo rodea, y conduce a una morbilidad significativa a través de diversos estados patológicos. Después de una lesión, hay una transición de los fibroblastos para miofibroblastos, que luego se secretan componentes de ECM estructurales, ejercen efectos paracrinos en la vecina tipos de células, y restaurar la estabilidad mecánica mediante la deposición de tejido de cicatriz 6.
En los tejidos cutáneos existe una variación significativa en la calidad de la reparación de la herida a través del tiempo de desarrollo y entre los sitios anatómicos. En los dos primeros trimestres de la vida del feto se cura sin dejar cicatriz; Sin embargo, a partir del tercer trimestre de y durante la edad adulta, los seres humanos a sanar con una cicatriz. , Además de la edad específica, existen específica de sitio diferencias en la cicatrización de heridas. Las heridas en la cavidad oral remodelar con mínima formación de cicatriz 7,8, mientras que la deposición de tejido cicatricial dentro de heridas cutáneas es significativa 9. La controversia persiste concerning la influencia relativa del medio ambiente en comparación con las propiedades intrínsecas de los fibroblastos locales sobre el resultado de la cicatrización de heridas en lo que respecta a la edad y la ubicación 10,11. Teniendo en cuenta las diferencias significativas en la curación de ratón por vía oral vs. dermis cutáneas y embrionario temprano (E15) vs. tarde embrionaria (E18) dermis, es probable que existan diferencias intrínsecas en las poblaciones de fibroblastos a ciertas edades y de desarrollo entre los diversos sitios anatómicos .
En 1986, Harold F. Dvorak postuló tumores son heridas que no cicatrizan 12. Dvorak llegó a la conclusión de que los tumores se comportan como las heridas en el cuerpo y su estroma inducen mediante la activación de la respuesta de cicatrización de la herida del huésped. Ya que numerosos estudios han investigado la contribución de los fibroblastos para la progresión de los carcinomas de 13-15, pero como en el caso de la cicatrización de heridas, la identidad y el origen embrionario de los fibroblastos que contribuyen a la compartimiento del estroma de ca cutánearcinomas no se ha definido de manera adecuada. La respuesta a esta pregunta tiene relevancia médica dada estudios recientes que exponen el fibroblasto asociado al tumor como un objetivo potencialmente eficaz para la terapia contra el cáncer 16.
La identificación y el aislamiento de forma prospectiva los linajes de fibroblastos dotados de potencial fibrogénica in vivo es un paso esencial para manipular eficazmente su respuesta a una lesión en una amplia gama de enfermedades agudas y crónicas. En 1987, Cormack demostró dos subpoblaciones de fibroblastos, uno que reside dentro de la papilar y una dentro de la dermis reticular 17,18. Una tercera subpoblación se encontró asociado con los folículos pilosos de la región papila dérmica del 19,20 folículo. Cuando cultivadas, estas diferencias subtipos fibroblastos exhiben en el potencial de crecimiento, morfología y del factor de crecimiento / citoquinas perfiles 21-24.
Hasta la fecha, los estudios que examinan los fibroblastos queterogeneity han fracasado en gran medida para caracterizar adecuadamente la diversidad del desarrollo y funcional entre los fibroblastos in vivo. Esto es, en parte, es el resultado de una dependencia de poblaciones de fibroblastos cultivadas y el efecto homogeneizante de cultivo celular o selección positiva sobre la base de un receptor de superficie de uno mismo no se expresa por todos los fibroblastos 25. Un estudio reciente de nuestro laboratorio demostraron un marcador de superficie profunda y cambio transcripcional en cultivos de fibroblastos vs. incultos aislados por la metodología basada en el aislamiento FACS presentado en este manuscrito 26.
Posteriormente, se identificaron un linaje de fibroblastos específico dentro de la dermis dorsal murinos y determinamos que este linaje, que se define por la expresión embrionaria de Engrailed-1, es el principal responsable de la deposición de tejido conectivo en la piel dorsal. Las funciones de linaje durante ambas formas agudas y crónicas de la fibrosis, incluyendo la cicatrización de heridas, la formación de estroma cáncer, yradiación indujo fibrosis 27. La caracterización de los linajes de fibroblastos diferenciados tiene implicaciones importantes para las terapias dirigidas a la modulación de la conducta fibrogénica.
En lugar de utilizar protocolos existentes que se basan en la manipulación in vitro para lograr el aislamiento de células 28,29, el protocolo de la cosecha (Figura 1) se detalla aquí ayudará análisis informativos de rendimiento de los fibroblastos que capturan con mayor precisión el fenotipo y el comportamiento in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo se describe en este manuscrito ofrece un medio para aislar los fibroblastos de la clasificación basada en la FACS, en comparación con los métodos existentes, que seleccionar para una subpoblación o requieren tiempo en cultivo celular antes de los análisis posteriores. El tiempo requerido desde la cosecha de la piel a la clasificación de los fibroblastos es de aproximadamente 6 horas; sin embargo, el número de ratones utilizados en la cosecha influirá en esta estimación.
…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención del NIH subvención R01 GM087609 (a HPL), un regalo de Ingrid Lai y Bill Shu en honor a Anthony Shu (a HPL), NIH U01 subvención HL099776 (a MTL), el Laboratorio Hagey para Pediátrica Medicina Regenerativa y La Fundación Oak (al MTL, GCG y HPL). GGW recibió el apoyo de la Escuela de Medicina de Stanford, el Programa de Capacitación de Stanford Medical Scientist, y GM07365 beca de formación NIGMS. ZNM fue apoyado por la Cirugía Plástica Fundación de Becas de Investigación Grant y el Fondo de la Familia Hagey. MSH fue apoyado por el Instituto de Medicina Regenerativa de California (CIRM) Becario Clínico beca de formación TG2-01159, la Sociedad Americana de Cirujanos Maxilofaciales (ASMS) / Maxilofacial Cirujanos Foundation (MSF) Premio Beca de Investigación, y el Trasplante y Tissue Engineering Award Fellowship.
Materials
| Surgical Forceps | Kent Scientific | INS650916 | |
| Micro-scissors | Kent Scientific | INS600127 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| Nair (depilatory cream) | Church and Dwight Co. | 22600267058 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Elastase | Abcam | ab95133 | |
| DMEM | Life Technologies | A14430-01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| 40 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 70 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 100 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CD31 | BioLegend | 102421 | |
| CD45 | BioLegend | 103125 | |
| Tie2 | BioLegend | 124005 | |
| Ter-119 | BioLegend | 116233 | |
| EpCAM (CD326) | eBioscience | 48-5791 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| propidium iodide (PI viability stain) | BioLegend | 421301 |
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