Мышиные Кожные фибробластов Изоляция FACS
Summary
Fibroblast behavior underlies a spectrum of clinical entities, but they remain poorly characterized, largely due to their inherent heterogeneity. Traditional fibroblast research relies upon in vitro manipulation, masking in vivo fibroblast behavior. We describe a FACS-based protocol for the isolation of mouse skin fibroblasts that does not require cell culture.
Abstract
Фибробласты принцип тип клеток отвечает за секретирующие внеклеточный матрикс и являются важным компонентом многих органов и тканей. Фибробластов физиологии и патологии лежат спектр клинических лиц, в том фиброзов в различных органах, гипертрофических рубцов следующих ожогов, потери сердечной функции после ишемии, и формирование рака стромы. Тем не менее, фибробласты остаются плохо охарактеризованы тип клеток, в основном из-за присущей им неоднородности. Существующие методы выделения фибробластов требует времени в культуре клеток, что глубоко влияет клеток фенотип и поведение. Следовательно, многие исследования следственные фибробластов биологии полагаться на манипуляции в пробирке и не точно запечатлеть поведение фибробластов в естественных условиях. Чтобы преодолеть эту проблему, мы разработали протокол FACS основе для изоляции фибробластов из спинной кожи взрослых мышей, которые не требуют культуры клеток, тем самым preserviнг физиологическую транскрипции и протеомный профиль каждой ячейки. Наша стратегия позволяет исключения, не мезенхимальных линий через клонов отрицательной ворот (Лин -), а не позитивной стратегии выбора, чтобы избежать предварительного отбора или обогащения субпопуляции фибробластов выражения конкретных поверхностных маркеров и быть как можно более через это гетерогенная тип клеток.
Introduction
Фибробласты часто определяется морфологически веретенообразных клеток, которые придерживаются пластиковых подложках. Фибробласты принцип тип клеток отвечает за синтез и реконструкции внеклеточного матрикса в эмбриональных и взрослых органов 1. Фибробласты, таким образом, решающее значение для развития млекопитающих и вносят существенный вклад в внеклеточной среде, которая влияет на поведение соседних типов клеток, присутствующих в каждой ткани и органа.
Фибробласты также основной тип клеток за разнообразный набор медицинских условий, которые вызывают огромный клинический бремя. Патологические активности фибробластов ухудшает нормальную функцию ткани и включает в себя тканей и органов фиброз (например, легких и печени), рубцевание следующую кожного заживления ран, атеросклероз, системный склероз, и формирование атероматозных бляшек после травмы сосудов 2-5. Заживление ран, в частности, как остро и хронически, включает Deposition рубцовой ткани, что ни походит ни функционирует подобно нормальной ткани, окружающей его, и приводит к значительной заболеваемости в самых разнообразных патологических состояниях. После травмы, происходит переход фибробластов в миофибробластами, который затем выделяют структурные компоненты ECM, оказывают воздействие на паракринные соседних типов клеток, и восстановить механическую стабильность путем осаждения рубцовой ткани 6.
В кожных тканей существует значительное изменение в качество заживления ран через время развития, а также между анатомических участков. В первых двух триместров жизни плод лечит без рубцов; Однако, начиная с третьего триместра на протяжении взрослой жизни и, люди исцелить со шрамом. Сайт-специфическая, в дополнение к возрасту конкретного различия в заживлении ран существует. Раны в ротовой полости переделывать с минимальным образованием рубцов 7,8, в то время как осаждение рубцовой ткани в кожных ран значительным 9. Споры сохраняется грoncerning относительное влияние окружающей среды по сравнению с внутренними свойствами местных фибробластов на исход заживления ран в отношении как возраст и место 10,11. Учитывая значительные различия в исцелении мыши устной против кожных дермы и ранее эмбриональных (E15) против позже эмбриональных (E18) дермы, вполне вероятно, что внутренние различия в популяциях фибробластов в определенном возрасте развития и среди различных анатомических существует ,
В 1986 году Гарольд Ф. Дворжак положено опухоли раны, которые не заживают 12. Dvorak к выводу, что опухоли ведут себя как раны в организме и вызывают их стромы путем активации заживления раны ответ хозяина. Многочисленные исследования, так как исследовали вклад фибробластов к прогрессированию рака 13-15, но как и в случае заживления раны, идентичности и эмбрионального происхождения фибробластов, которые способствуют стромы отсеке кожного CArcinomas не были должным образом определены. Ответ на этот вопрос носит медицинскую значимость данной недавние исследования, разоблачающие опухолеассоциированные фибробластов как потенциально эффективного мишени для противораковой терапии 16.
Выявление и перспективно изоляции фибробластов клоны наделены фиброгенной потенциала в естественных условиях является важным шагом на пути к эффективной манипуляции их ответ на повреждение в широком диапазоне острых и хронических болезненных состояний. В 1987 году Кормак продемонстрировал два субпопуляции фибробластов, один проживающий в папиллярного и один в ретикулярной дермы 17,18. Третий субпопуляции был найден, связанные с волосяных фолликулов в волосяной сосочек области фолликула 19,20. При культивировании, эти различия фибробластов подтипы проявляют в потенциал роста, морфологии и факторов роста / цитокинов анкеты 21-24.
На сегодняшний день, исследования по изучению фибробластов онterogeneity в значительной степени удалось адекватно характеризуют развития и функционального разнообразия среди фибробластов в естественных условиях. Это, в частности, является результатом зависимости от культивируемых популяций фибробластов и гомогенизации эффекта клеточной культуре или позитивной селекции на основе поверхностного рецептора себя не экспрессируется всеми фибробластов 25. Недавнее исследование, из нашей лаборатории показали глубокое поверхностный маркер и транскрипции сдвиг в культуре фибробластов против некультурных изолированных на FACS на основе методологии, представленной в изоляции этой рукописи 26.
Впоследствии, мы определили конкретный фибробластов происхождение в пределах мышиных спинных дермы и решил, что это линия, определяется эмбриональной экспрессии Engrailed-1, в первую очередь отвечает за отложение соединительной ткани в коже спинной. Линии функции при острых и хронических форм фиброза в том числе заживление ран, образование стромы рака, иизлучение фиброз 27. Характеристика различных фибробластов линий имеет критические последствия для лечения, направленных на модуляции фиброгенную поведение.
Вместо того чтобы использовать существующие протоколы, которые полагаются на манипуляции в пробирке для достижения изоляции клеток 28,29, протокол урожай (Рисунок 1) подробно здесь, поможет урожая информативные анализы фибробластов, которые более точно захватить фенотип и поведение в естественных условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный в этой рукописи предлагает средства, чтобы изолировать от фибробластов FACS-сортировки на основе, по сравнению с существующими методами, которые либо выбрать для субпопуляции или требуют времени в культуре клеток, прежде чем последующих анализов. Время, необходимое ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана грантом NIH грант R01 GM087609 (до HPL), подарок от Ингрид Лай и Билл Шу в честь Энтони Шу (в HPL), NIH грант U01 HL099776 (к MTL), в Hagey лаборатории Детская регенеративной медицины и Дуб Фонд (для MTL, GCG и HPL). GGW поддержали Стэнфордской школы медицины, программы обучения Стэнфордского медицинского ученого, и NIGMS субсидия на обучение GM07365. Znm при поддержке Фонда пластической хирургии исследовательский грант Грант и Семейный фонд Hagey. MSH при поддержке Калифорнийского института регенеративной медицины (CIRM) Клиническая сотрудник учебного пособия TG2-01159, Американского общества челюстно-лицевых хирургов (ASMS) / челюстно-лицевых хирургов Foundation (MSF) исследований выдаче гранта, и трансплантации и тканевой инженерии стипендий премии.
Materials
| Surgical Forceps | Kent Scientific | INS650916 | |
| Micro-scissors | Kent Scientific | INS600127 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| Nair (depilatory cream) | Church and Dwight Co. | 22600267058 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Elastase | Abcam | ab95133 | |
| DMEM | Life Technologies | A14430-01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| 40 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 70 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 100 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CD31 | BioLegend | 102421 | |
| CD45 | BioLegend | 103125 | |
| Tie2 | BioLegend | 124005 | |
| Ter-119 | BioLegend | 116233 | |
| EpCAM (CD326) | eBioscience | 48-5791 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| propidium iodide (PI viability stain) | BioLegend | 421301 |
References
- Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblasts-a diverse population at the center of it all. International review of cell and molecular biology. 276, 161-214 (2009).
- Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of pathology. 214, 199-210 (2008).
- Powell, D. W., et al. Myofibroblasts. I. Paracrine cells important in health and disease. The American journal of physiology. 277, C1-C9 (1999).
- Wilson, M. S., Wynn, T. A. Pulmonary fibrosis: pathogenesis, etiology and regulation. Mucosal immunology. 2, 103-121 (2009).
- Hinz, B., et al. The myofibroblast: one function, multiple origins. The American journal of pathology. 170, 1807-1816 (2007).
- Li, B., Wang, J. H. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing: force generation and measurement. J Tissue Viability. 20, 108-120 (2011).
- Wong, J. W., et al. Wound healing in oral mucosa results in reduced scar formation as compared with skin: evidence from the red Duroc pig model and humans. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 17, 717-729 (2009).
- Szpaderska, A. M., Zuckerman, J. D., DiPietro, L. A. Differential injury responses in oral mucosal and cutaneous wounds. Journal of dental research. 82, 621-626 (2003).
- Hantash, B. M., Zhao, L., Knowles, J. A., Lorenz, H. P. Adult and fetal wound healing. Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 13, 51-61 (2008).
- Buchanan, E. P., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Fetal skin wound healing. Advances in clinical chemistry. 48, 137-161 (2009).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Dvorak, H. F. Tumors: wounds that do not heal. Similarities between tumor stroma generation and wound healing. The New England journal of medicine. 315, 1650-1659 (1986).
- Dumont, N., et al. Breast fibroblasts modulate early dissemination, tumorigenesis, and metastasis through alteration of extracellular matrix characteristics. Neoplasia. 15, 249-262 (2013).
- Servais, C., Erez, N. From sentinel cells to inflammatory culprits: cancer-associated fibroblasts in tumour-related inflammation. The Journal of pathology. 229, 198-207 (2013).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell cycle. 5, 1597-1601 (2006).
- Li, X., et al. Targeting the cancer-stroma interaction: a potential approach for pancreatic cancer treatment. Current pharmaceutical design. 18, 2404-2415 (2012).
- Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblast heterogeneity: more than skin deep. Journal of cell science. 117, 667-675 (2004).
- Cormack, D. H. . Ham’s Histology. , 450-474 (1987).
- Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. Dermal-epidermal interactions. Adult follicle-derived cell populations and hair growth. Dermatologic clinics. 14, 573-583 (1996).
- Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. Hair follicle dermal sheath cells: unsung participants in wound healing. Lancet. 358, 1445-1448 (2001).
- Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Construction of a bilayered dermal equivalent containing human papillary and reticular dermal fibroblasts: use of fluorescent vital dyes. Tissue engineering. 2, 39-49 (1996).
- Harper, R. A., Grove, G. Human skin fibroblasts derived from papillary and reticular dermis: differences in growth potential in vitro. Science. 204, 526-527 (1979).
- Schafer, I. A., Pandy, M., Ferguson, R., Davis, B. R. Comparative observation of fibroblasts derived from the papillary and reticular dermis of infants and adults: growth kinetics, packing density at confluence and surface morphology. Mechanisms of ageing and development. 31, 275-293 (1985).
- Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Site-matched papillary and reticular human dermal fibroblasts differ in their release of specific growth factors/cytokines and in their interaction with keratinocytes. Journal of cellular physiology. 200, 134-145 (2004).
- Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of visualized experiments : JoVE. , e4425 (2013).
- Walmsley, G. G., et al. Live Fibroblast Harvest Reveals Surface Marker Shift in vitro. Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).
- Rinkevich, Y., Walmsley, G. G., Hu, M. S., Maan, Z. N., Newman, A. M., Drukker, M., Januszyk, M., Krampitz, G. W., Gurtner, G. C., Lorenz, H. P., Weissman, I. L., Longaker, M. T. Identification and Isolation of a Dermal Lineage with Intrinsic Fibrogenic Potential. Science. , (2015).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. J Vis Exp. , (2010).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature protocols. 3, 799-810 (2008).
- Klein, M., Fitzgerald, L. R. Enzymatic separation of intact epidermal sheets from mouse skin. The Journal of investigative dermatology. 39, 111-114 (1962).
- Biburger, M., Trenkwald, I., Nimmerjahn, F. yThree blocks are not enough – Blocking of the murine IgG receptor FcgammaRIV is crucial for proper characterization of cells by FACS analysis. European journal of immunology. , (2015).
