Computed Tomography en optische beeldvorming van Osteogenesis-angiogenese Koppeling te beoordelen Integratie van schedelbot Autografts en Allografts
Summary
Implantatie van autologe en allogene bottransplantaten, vormen aanvaarde benaderingen tot grote craniofaciale botverlies te behandelen. Toch is het effect van transplantaat samenstelling op de interactie tussen neovascularisatie, celdifferentiatie en botvorming is onduidelijk. We presenteren een multimodale beeldvorming protocol gericht op de angiogenese-osteogenese afhankelijkheid van het transplantaat nabijheid helderen.
Abstract
Een belangrijke parameter voor het succes van een bot-enten procedure vascularisatie van de omgeving van het implantaat. Onze hypothese was dat de implantatie van een bot autograft zou meer bot regeneratie door overvloedige vorming van bloedvaten veroorzaken. Om het effect van het transplantaat neovascularisatie op de defectlocatie onderzoeken hebben we een micro-computertomografie (μCT) aanpak nieuw karakteriseren vormen bloedvaten, die systemische perfusie van de dieren met een polymeriserende contrastmiddel omvat. Deze werkwijze levert hen vasculaire analyse van een orgaan in zijn geheel. Daarnaast werd doorbloeding beoordeeld met behulp van fluorescentie beeldvorming (FLI) van een bloed-gedragen fluorescerend middel. Botvorming werd gekwantificeerd met behulp van een FLI-hydroxyapatiet gerichte probe en μCT analyse. Stamcelrekrutering werd gevolgd door bioluminescentie (BLI) van transgene muizen die luciferase tot expressie onder de controle van de osteocalcine-promoter.Hier beschrijven en demonstreren voorbereiding van de allograft, calvarial defect chirurgie wij μCT scannen protocollen voor de neovascularisatie studie en botvorming analyse (met inbegrip van de in vivo perfusie van contrastmiddel), en het protocol voor data-analyse.
De 3D hoge resolutie analyse van vasculatuur significant grotere angiogenese bij dieren met geïmplanteerde autografts, vooral met betrekking tot arteriole formatie. Dienovereenkomstig doorbloeding was de autotransplantaatgroep significant hoger bij de 7e dag na de operatie. We waargenomen superieure botmineralisatie en gemeten grotere botvorming bij dieren die autografts ontvangen. Autograft implantatie geïnduceerde inwoner stamcellen rekrutering van de graft-gastheer bot hechtdraad, waarbij de cellen gedifferentieerd in botvormende cellen tussen de 7 e en de 10 e dag na de operatie. Deze vondst betekent dat verbeterde botvorming kan worden toegeschreven aanaugmented vasculaire voeden dat autograft implantatie kenmerkt. De methoden afgeschilderd kan als een optimaal instrument om botregeneratie studeren in termen van goed begrensd vorming en de vorming van nieuwe bloedvaten bot dienen.
Introduction
Craniofaciale botverlies als gevolg van trauma, tumor resectie, decompressie craniotomie en aangeboren afwijking zelden geneest vanzelf en presenteert een duidelijke onvervulde klinische behoefte. Autologe bottransplantaten en allogene bottransplantaten worden op grote schaal gebruikt om deze aandoeningen te behandelen 1.
Het is algemeen aanvaard dat osteogenesis strak gekoppeld aan angiogenese 2,3. Daarom moet de volledige studie van een beoogde therapie voor botherstel omvatten een uitgebreid onderzoek van de vasculaire boom vormt het gehele defectlocatie. Er zijn verschillende beschikbare methoden om vascularization karakteriseren onderzoeksmodellen. De endotheelcellen kan worden onderzocht door histologische analyse. Aangezien histologie voert snijden weefsel, is er een grote kans dat het resulterende beeld wordt vervormd. Om dit probleem aan te pakken, kan opklaren worden uitgevoerd om het intacte bloedvaten 4; deze wijze isbeperkt tot één vlak imaging. μCT doorzoeken van specimens afkomstig van een dier geperfuseerd met contrastmiddel maakt 3D beeldvorming van het vasculaire netwerk dat de regeneratieplaats 5 voedt. Deze benadering maakt een zeer gedetailleerde demonstratie van de vasculatuur een orgaan als geheel, evenals een zorgvuldige analyse van de distributie bloedvat. Bovendien μCT maakt onderscheid tussen de verschillende diameters van de bloedvaten die de verschillende subtypes van bloedvaten te karakteriseren.
Onze hypothese was dat implantatie van een calvarial autograft groter zal zijn dan neovascularisatie implantatie van een allograft te induceren, en deze verhoogde neovascularisatie leidt op zijn beurt tot een verhoogde bot formation.To hypothese gebruikten we verschillende technieken oefenen. We onderzochten patronen van de nieuw gevormde vasculaire boom door het uitvoeren van een μCT-gebaseerde analyse. We gemeten doorbloeding met behulp van een bloed-zwembad fluorescente probe. Vervolgens hebben we ezelssed botweefsel mineralisatie door FLI van een hydroxyapatiet gericht sonde en μCT analyse. Ten slotte hebben we gecontroleerd stam werving en differentiatie cel, het uitvoeren van BLI in transgene muizen die luciferase wordt uitgedrukt in osteocalcine-positieve cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Doel van multimodale beeldvormingstechnieken hier beschreven nauwgezet onderzoek naar de angiogenese-osteogenese as in de context van craniale bottransplantatie mogelijk. Neovascularisatie werd in beeld gebracht met behulp van een μCT protocol, dat een nauwkeurige hoge-resolutie 3D-demonstratie van de vasculaire boom liet het voeden van de hele craniale defect. μCT gegevens kunnen gemakkelijk worden geanalyseerd met behulp van geavanceerde tools zoals IPL-software. Bijvoorbeeld, de dikte analyse getoond in fig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding from the NIDCR (Grant No. DE019902) and from the Israeli Science Foundation (Grant No. 382/13).
Materials
| C57BL/C Mice | Harlan laboratories | 57 | |
| FVB/n Mice | Harlan laboratories | 862 | |
| Phenobarbital | West waro | NDC 0641-0477-25 | |
| Rodent hair clipper | Wahl animal | 8786-451A | |
| Scalpel 11 | Miltex | 27111504 | |
| Dental micro motor | marathon III | ||
| 5mm trephine | Fine Science tools | 18004-50 | |
| Hair removing cream | Veet | ||
| KetaVed (Ketamine) | Vedco | NDC 50989-996-06 | |
| Domitor | Zoetis | NADA 141-267 | |
| carprofen | Norbrook | 02000/4229 | |
| Eye ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Operating binocular | Kent scientific | KSCXTS-1121 | |
| Fine scissors | Fine Science tools | 14060-11 | |
| Curve tweezers | Fine Science tools | 11274-20 | |
| Spoon shaped spatula | Fine Science tools | 10090-13 | |
| Tisseel Fibin gel kit | Baxter | 718971 | |
| needle holder | Fine Science tools | 12060-01 | |
| vicryl suture 4-0 | Ethicon | J392H | |
| Antisedan | Zoetis | NADA#141033 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| 20ml luerlock | BD | 302830 | |
| 23G scalp vein set (butterfly needle) | BD | 367342 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13008-12 | |
| Syringe pump | Harvard apparatus | PHD 2000 | |
| 3sec gel glue | Scotch | ||
| rodent dissection board | Leica | 38DI02313 | |
| Microfil MV-122 | flow-tech | MV-122 | |
| uCT40 scanner | Scanco | uCT40 | |
| TCA6% | Sigma | T6399 | |
| Osteosense 680 | PerkinElmar | NEV10020EX | |
| Angiosense750 | PerkinElmar | NEV10011 | |
| Oxigen 100% medical grade | |||
| isoflurane (furane) | Baxter | 1001936040 | |
| IVIS kinetics | Xenogen | ||
| Beetle luciferin | Promega | E160A |
References
- Finkemeier, C. G. Bone-grafting and bone-graft substitutes. J Bone Joint Surg Am. 84-A (3), 454-464 (2002).
- Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. Osteogenesis and angiogenesis: the potential for engineering bone. Eur Cell Mater. 15, 100-114 (2008).
- Schipani, E., Maes, C., Carmeliet, G., Semenza, G. L. Regulation of osteogenesis-angiogenesis coupling by HIFs and VEGF. J Bone Miner Res. 24 (8), 1347-1353 (2009).
- Huang, C., et al. Spatiotemporal Analyses of Osteogenesis and Angiogenesis via Intravital Imaging in Cranial Bone Defect. J Bone Miner Res. , (2015).
- Kimelman-Bleich, N., et al. The use of a synthetic oxygen carrier-enriched hydrogel to enhance mesenchymal stem cell-based bone formation in vivo. Biomaterials. 30 (27), 4639-4648 (2009).
- Iris, B., et al. Molecular imaging of the skeleton: quantitative real-time bioluminescence monitoring gene expression in bone repair and development. J Bone Miner Res. 18 (3), 570-578 (2003).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
- Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nat Protoc. 6 (1), 105-110 (2011).
- Fleming, J. T., et al. Bone blood flow and vascular reactivity. Cells Tissues Organs. 169 (3), 279-284 (2001).
- Dhillon, R. S., et al. PTH-enhanced structural allograft healing is associated with decreased angiopoietin-2-mediated arteriogenesis, mast cell accumulation, and fibrosis. J Bone Miner Res. 28 (3), 586-597 (2013).
- Nebuloni, L., Kuhn, G. A., Vogel, J., Muller, R. A. A novel in vivo vascular imaging approach for hierarchical quantification of vasculature using contrast enhanced micro-computed tomography. PLoS One. 9 (1), e86562 (2014).
- Zhang, X., et al. Periosteal progenitor cell fate in segmental cortical bone graft transplantations: implications for functional tissue engineering. J Bone Miner Res. 20 (12), 2124-2137 (2005).
- Movahed, R., Pinto, L. P., Morales-Ryan, C., Allen, W. R., Wolford, L. M. Application of cranial bone grafts for reconstruction of maxillofacial deformities. Proc (Bayl Univ Med Cent). 26 (3), 252-255 (2013).
- Putters, T. F., Schortinghuis, J., Vissink, A., Raghoebar, G. M. A prospective study on the morbidity resulting from calvarial bone harvesting for intraoral reconstruction. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Kline, R. M., Wolfe, S. A. Complications associated with the harvesting of cranial bone grafts. Plast Reconstr Surg. 95 (1), 5-13 (1995).
- Hassanein, A. H., et al. Effect of calvarial burring on resorption of onlay cranial bone graft. J Craniofac Surg. 23 (5), 1495-1498 (2012).
- Yin, J., Jiang, Y. Completely resorption of autologous skull flap after orthotopic transplantation: a case report. Int J Clin Exp Med. 7 (4), 1169-1171 (2014).
- Schuss, P., et al. Bone flap resorption: risk factors for the development of a long-term complication following cranioplasty after decompressive craniectomy. J Neurotrauma. 30 (2), 91-95 (2013).
- Ben Arav, A., et al. Adeno-associated virus-coated allografts: a novel approach for cranioplasty. J Tissue Eng Regen Med. 6 (10), e43-e50 (2012).
- Ito, H., et al. Remodeling of cortical bone allografts mediated by adherent rAAV-RANKL and VEGF gene therapy. Nat Med. 11 (3), 291-297 (2005).
- Sheyn, D., et al. PTH promotes allograft integration in a calvarial bone defect. Mol Pharm. 10 (12), 4462-4471 (2013).
- Jain, R. K. Molecular regulation of vessel maturation. Nat Med. 9 (6), 685-693 (2003).
- Reginato, S., Gianni-Barrera, R., Banfi, A. Taming of the wild vessel: promoting vessel stabilization for safe therapeutic angiogenesis. Biochem Soc Trans. 39 (6), 1654-1658 (2011).
- Moutsatsos, I. K., et al. Exogenously regulated stem cell-mediated gene therapy for bone regeneration. Mol Ther. 3 (4), 449-461 (2001).
- Deckers, M. M., et al. Bone morphogenetic proteins stimulate angiogenesis through osteoblast-derived vascular endothelial growth factor. A. Endocrinology. 143 (4), 1545-1553 (2002).
- Cornejo, A., et al. Effect of adipose tissue-derived osteogenic and endothelial cells on bone allograft osteogenesis and vascularization in critical-sized calvarial defects. Tissue Eng Part A. 18 (15-16), 1552-1561 (2012).
