Tomografia Computerizzata e Optical Imaging di osteogenesi-angiogenesi Accoppiamento per valutare l'integrazione di craniche Bone Autoinnesti e Alloinnesti
Summary
L'impianto di innesti ossei autologhi e allogenici costituiscono accettato approcci per trattare la perdita di massa ossea cranio-facciale. Eppure l'effetto della composizione trapianto sull'interazione tra neovascolarizzazione, la differenziazione cellulare e la formazione delle ossa non è chiaro. Vi presentiamo un protocollo di imaging multimodale mira a chiarire l'interdipendenza angiogenesi-osteogenesi in prossimità dell'innesto.
Abstract
Un importante parametro determinante il successo di una procedura di innesto osseo-è vascolarizzazione della zona circostante l'innesto. Abbiamo ipotizzato che l'impianto di un osso autologo indurrebbe una maggiore rigenerazione ossea da una ricca formazione dei vasi sanguigni. Per studiare l'effetto del trapianto sulla neovascolarizzazione presso il sito del difetto, abbiamo sviluppato una tomografia (μCT) approccio micro-computerizzata per caratterizzare nuova formazione dei vasi sanguigni, che coinvolge la perfusione sistemica dell'animale con un mezzo di contrasto polimerizzazione. Questo metodo consente un'analisi dettagliata vascolare di un organo nella sua interezza. Inoltre, perfusione sanguigna è stata valutata utilizzando imaging di fluorescenza (FLI) di un agente fluorescente ematica. Formazione ossea è stata quantificata da FLI utilizzando una sonda di idrossiapatite mirato e analisi μCT. Reclutamento di cellule staminali è stato monitorato da bioluminescenza (BLI) di topi transgenici che esprimono luciferasi sotto il controllo del promotore osteocalcina.Qui si descrive e dimostrare preparazione del trapianto allogenico, chirurgia difetti cranica, μCT protocolli di scansione per lo studio e l'analisi neovascolarizzazione formazione ossea (tra cui la perfusione in vivo di mezzo di contrasto), e il protocollo per l'analisi dei dati.
L'analisi ad alta risoluzione 3D della vascolarizzazione dimostrata significativamente maggiore angiogenesi in animali con autoinnesti impiantati, soprattutto per quanto riguarda la formazione di arteriole. Di conseguenza, la perfusione sanguigna è risultata significativamente più alta nel gruppo autologo dal 7 ° giorno dopo l'intervento chirurgico. Abbiamo osservato mineralizzazione ossea superiore e una maggiore formazione ossea misurata negli animali che hanno ricevuto autoinnesti. Autotrapianto impianto residente indotto il reclutamento di cellule staminali per la sutura osso trapianto-ospite, dove le cellule differenziate in cellule che formano l'osso tra il 7 ° e 10 ° giorno post-operatorio. Questa scoperta significa che la formazione ossea maggiore può essere attribuito al'alimentazione vascolare aumentata che caratterizza l'impianto autologo. I metodi descritti possono servire come strumento ottimale per studiare la rigenerazione ossea in termini di formazione ossea strettamente delimitata e neovascolarizzazione.
Introduction
Perdita ossea craniofacciale causa di un trauma, la resezione del tumore, craniotomia decompressiva, e difetto congenito guarisce raramente da sola e presenta una chiara necessità clinica insoddisfatta. Innesti ossei autologhi e innesti ossei allogenici sono ampiamente utilizzati per trattare queste condizioni 1.
E 'ampiamente accettato che l'osteogenesi è strettamente accoppiato con angiogenesi 2,3. Pertanto, lo studio completo di una terapia proposto per la rigenerazione ossea dovrebbe includere un'indagine completa dell'albero vascolare formazione durante l'intero sito del difetto. Ci sono diversi metodi disponibili per caratterizzare vascolarizzazione in modelli di ricerca. L'albero vascolare può essere indagata mediante analisi istologica. Poiché istologia deduce sezionamento tessuto, vi è un'alta probabilità che l'immagine risultante sarà distorta. Per affrontare questo problema, la microscopia intravitale può essere eseguita per i vasi sanguigni intatti immagine 4; Tuttavia, questo metodo èlimitato a imaging solo piano. μCT scansione di campioni ottenuti da un animale perfuso con agente di contrasto permette imaging 3D della rete vascolare che alimenta il sito di rigenerazione 5. Questo approccio consente una dimostrazione estremamente dettagliata di vascolare di un organo nel suo complesso, nonché una meticolosa analisi della distribuzione dei vasi sanguigni. Inoltre, μCT consente differenziazione tra vari diametri dei vasi sanguigni, che caratterizzano i diversi sottotipi di vasi sanguigni.
Abbiamo ipotizzato che l'impianto di un innesto autologo cranica indurrà maggiore neovascolarizzazione di impianto di un allotrapianto, e questa maggiore neovascolarizzazione porterà, a sua volta, ad una maggiore osso formation.To perseguire questa ipotesi abbiamo utilizzato una varietà di tecniche. Abbiamo studiato i modelli di dell'albero vascolare di nuova formazione per l'esecuzione di un'analisi basata su μCT. Abbiamo misurato perfusione sanguigna utilizzando una sonda fluorescente sangue piscina. Successivamente, abbiamo asinised mineralizzazione del tessuto osseo da FLI di una sonda idrossiapatite-diretto e analisi μCT. Infine, abbiamo monitorato il reclutamento delle cellule staminali e la differenziazione, l'esecuzione di BLI in topi transgenici in cui luciferasi è espressa nelle cellule di osteocalcina-positivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo scopo degli approcci di imaging multimodali qui descritte è quello di consentire un'indagine meticolosa dell'asse angiogenesi-osteogenesi nel contesto cranica innesto osseo. Neovascolarizzazione è stato ripreso con un protocollo μCT, che ha permesso un accurato ad alta risoluzione dimostrazione 3D dell'albero vascolare che alimenta il vizio cranica. dati μCT possono essere facilmente analizzati utilizzando strumenti avanzati quali il software IPL. Ad esempio, l'analisi spessore mostrata in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding from the NIDCR (Grant No. DE019902) and from the Israeli Science Foundation (Grant No. 382/13).
Materials
| C57BL/C Mice | Harlan laboratories | 57 | |
| FVB/n Mice | Harlan laboratories | 862 | |
| Phenobarbital | West waro | NDC 0641-0477-25 | |
| Rodent hair clipper | Wahl animal | 8786-451A | |
| Scalpel 11 | Miltex | 27111504 | |
| Dental micro motor | marathon III | ||
| 5mm trephine | Fine Science tools | 18004-50 | |
| Hair removing cream | Veet | ||
| KetaVed (Ketamine) | Vedco | NDC 50989-996-06 | |
| Domitor | Zoetis | NADA 141-267 | |
| carprofen | Norbrook | 02000/4229 | |
| Eye ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Operating binocular | Kent scientific | KSCXTS-1121 | |
| Fine scissors | Fine Science tools | 14060-11 | |
| Curve tweezers | Fine Science tools | 11274-20 | |
| Spoon shaped spatula | Fine Science tools | 10090-13 | |
| Tisseel Fibin gel kit | Baxter | 718971 | |
| needle holder | Fine Science tools | 12060-01 | |
| vicryl suture 4-0 | Ethicon | J392H | |
| Antisedan | Zoetis | NADA#141033 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| 20ml luerlock | BD | 302830 | |
| 23G scalp vein set (butterfly needle) | BD | 367342 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13008-12 | |
| Syringe pump | Harvard apparatus | PHD 2000 | |
| 3sec gel glue | Scotch | ||
| rodent dissection board | Leica | 38DI02313 | |
| Microfil MV-122 | flow-tech | MV-122 | |
| uCT40 scanner | Scanco | uCT40 | |
| TCA6% | Sigma | T6399 | |
| Osteosense 680 | PerkinElmar | NEV10020EX | |
| Angiosense750 | PerkinElmar | NEV10011 | |
| Oxigen 100% medical grade | |||
| isoflurane (furane) | Baxter | 1001936040 | |
| IVIS kinetics | Xenogen | ||
| Beetle luciferin | Promega | E160A |
References
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