Computertomographie und Optical Imaging von Osteogenesis-Angiogenese-Kopplung an Integration von Schädelknochen Autografts und Allografts Beurteilen
Summary
Implantation von autologen und allogenen Knochentransplantaten bilden akzeptiert Ansätze zur Hauptgesichtsschädelknochenverlust zu behandeln. Doch die Wirkung der Transplantatzusammensetzung auf das Zusammenspiel zwischen den Neovaskularisation, Zelldifferenzierung und Knochenbildung, ist unklar. Wir präsentieren eine multimodale Bildgebungsprotokoll zum Ziel, die Angiogenese-Osteogenese Interdependenz im Transplantat Nähe aufzuklären.
Abstract
Ein wesentlicher Parameter für den Erfolg einer Knochentransplantation Verfahren ist Vaskularisierung der Umgebung des Transplantats. Wir vermuten, dass die Implantation eines Knochenautotransplantat würde größere Knochenregeneration durch reichliche Bildung von Blutgefäßen zu induzieren. Um die Wirkung des Implantats in Bezug auf Neovaskularisation an der Defektstelle zu untersuchen, einem Mikrocomputertomographie (μCT) Ansatz neu bildenden Blutgefäßen zu charakterisieren, die eine systemische Perfusion des Tieres mit einem polymerisierenden Kontrastmittel beinhaltet entwickelten wir. Diese Methode ermöglicht detaillierte Gefäßanalyse eines Organs in seiner Gesamtheit. Zusätzlich wurde die Durchblutung mit Fluoreszenz-Imaging (FLI) von durch Blut übertragene Fluoreszenzmittel beurteilt. Knochenbildung wurde von FLI quantifiziert unter Verwendung einer Hydroxyapatit-bezogene Sonde und μCT Analyse. Stammzellrekrutierung durch Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) von transgenen Mäusen, die Luciferase unter der Kontrolle des Promotors exprimieren Osteocalcin überwacht.Hier beschreiben und demonstrieren die Herstellung des Allotransplantats Schädeldefekt Operation μCT Scanprotokolle für die Neovaskularisation Studie und Knochenbildungsanalyse (einschließlich der in vivo-Perfusion von Kontrastmittel) und Protokoll für die Datenanalyse.
Die hochauflösende 3D-Analyse der Vaskulatur, einen signifikant höheren Angiogenese bei Tieren mit implantierten Transplantaten, insbesondere im Hinblick auf die Bildung Arteriole. Dementsprechend war die Durchblutung in der Autograftgruppe signifikant höher nach dem 7. Tag nach der Operation. Wir beobachteten, überlegene Knochenmineralisierung und gemessen wird, größer Knochenbildung bei Tieren, die Autotransplantate erhalten. Autograft-Implantation induzierten ansässigen Stammzellrekrutierung, um das Transplantat-Wirt-Knochennaht, wobei die Zellen in knochenbildenden Zellen zwischen dem 7. und 10. postoperativen Tag differenziert. Dieses Ergebnis bedeutet, dass erhöhte Knochenbildung zugerechnet werden kanndas erweiterte Gefäß Fütterung, die Autograft-Implantation charakterisiert. Die Methoden dargestellt kann als optimales Werkzeug, um die Knochenregeneration in Bezug auf die dicht begrenzt Knochenbildung und Neovaskularisation studieren zu dienen.
Introduction
Kraniofazialen Knochenschwund aufgrund des Traumas, Tumorresektion decompressive Kraniotomie und Geburtsfehler selten heilt von selbst und stellt eine klare ungedeckten klinischen Bedarf. Autologen Knochentransplantaten und allogenen Knochentransplantate werden in großem Umfang verwendet werden, um diese Bedingungen zu 1 zu behandeln.
Es ist weithin anerkannt, dass die Osteogenese ist eng mit Angiogenese 2,3 gekoppelt. Somit sollte die gesamte Studie einer vorgeschlagenen Therapie zur Knochenregeneration eine umfassende Untersuchung des Gefäßbaumes bilden über die gesamte Defektstelle zu schließen. Es gibt mehrere Methoden, um die Vaskularisierung verfügbar in Forschungsmodelle zu charakterisieren. Das Gefäßbaum kann durch eine histologische Analyse untersucht werden. Da Histologie beruht auf Schnittgewebe, besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass das sich ergebende Bild wird verzerrt. Um dieses Problem anzugehen, kann Intravitalmikroskopie für Bild in intakten Blutgefäße 4 durchgeführt werden; Jedoch ist dieses Verfahrenauf ein Ebenentechnik beschränkt. μCT Abtastung von Proben aus einem Tier mit Kontrastmittel durchströmt erhalten ermöglicht 3D-Bildgebung des Gefäßnetz, die die Regeneration Website 5-Feeds. Dieser Ansatz ermöglicht eine sehr detaillierte Demonstration des Gefäßsystems eines Organs als Ganzes, sowie eine sorgfältige Analyse der Blutgefäßverteilung. Darüber hinaus ermöglicht die μCT Unterscheidung zwischen abwechslungsreichen Durchmesser der Blutgefäße, die die verschiedenen Untertypen von Blutgefäßen zu charakterisieren.
Wir vermuten, dass die Implantation einer Schädelautograft größer Neovaskularisation als Implantation eines Allograft zu induzieren, und diese erhöhte Gefäßneubildung führen wird, die wiederum zu einer verbesserten Knochen formation.To diese Hypothese beschäftigten wir eine Vielzahl von Techniken zu verfolgen. Wir untersuchten Mustern des neugebildeten Gefäßbaum durch Ausführen einer μCT basierte Analyse. Wir messen die Durchblutung mit Hilfe eines Blutpool Fluoreszenzsonde. Als nächstes haben wir Ärschesed Knochengewebe Mineralisierung von FLI einer Hydroxyapatit-gerichteten Sonde und μCT Analyse. Schließlich überwacht wir Stammzellrekrutierung und Differenzierung, die Durchführung BLI in transgenen Mäusen, in denen Luciferase in Osteocalcin-positiven Zellen exprimiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Ziel der hier beschriebenen multimodale Bildgebung Ansätze ist es, sorgfältige Untersuchung der Angiogenese-Osteogenese Achse im Rahmen der Schädelknochentransplantation zu ermöglichen. Neovaskularisation wurde unter Verwendung eines μCT-Protokoll, das eine genaue hochauflösende 3D-Demonstration des Gefäßbaumes erlaubt Zuführen des gesamten Schädeldefekt abgebildet. μCT Daten können leicht analysiert werden mit Hilfe modernster Tools wie IPL-Software. Zum Beispiel kann die Dicke Analyse in</stron…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding from the NIDCR (Grant No. DE019902) and from the Israeli Science Foundation (Grant No. 382/13).
Materials
| C57BL/C Mice | Harlan laboratories | 57 | |
| FVB/n Mice | Harlan laboratories | 862 | |
| Phenobarbital | West waro | NDC 0641-0477-25 | |
| Rodent hair clipper | Wahl animal | 8786-451A | |
| Scalpel 11 | Miltex | 27111504 | |
| Dental micro motor | marathon III | ||
| 5mm trephine | Fine Science tools | 18004-50 | |
| Hair removing cream | Veet | ||
| KetaVed (Ketamine) | Vedco | NDC 50989-996-06 | |
| Domitor | Zoetis | NADA 141-267 | |
| carprofen | Norbrook | 02000/4229 | |
| Eye ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Operating binocular | Kent scientific | KSCXTS-1121 | |
| Fine scissors | Fine Science tools | 14060-11 | |
| Curve tweezers | Fine Science tools | 11274-20 | |
| Spoon shaped spatula | Fine Science tools | 10090-13 | |
| Tisseel Fibin gel kit | Baxter | 718971 | |
| needle holder | Fine Science tools | 12060-01 | |
| vicryl suture 4-0 | Ethicon | J392H | |
| Antisedan | Zoetis | NADA#141033 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| 20ml luerlock | BD | 302830 | |
| 23G scalp vein set (butterfly needle) | BD | 367342 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13008-12 | |
| Syringe pump | Harvard apparatus | PHD 2000 | |
| 3sec gel glue | Scotch | ||
| rodent dissection board | Leica | 38DI02313 | |
| Microfil MV-122 | flow-tech | MV-122 | |
| uCT40 scanner | Scanco | uCT40 | |
| TCA6% | Sigma | T6399 | |
| Osteosense 680 | PerkinElmar | NEV10020EX | |
| Angiosense750 | PerkinElmar | NEV10011 | |
| Oxigen 100% medical grade | |||
| isoflurane (furane) | Baxter | 1001936040 | |
| IVIS kinetics | Xenogen | ||
| Beetle luciferin | Promega | E160A |
References
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