Tomografía Computarizada e Imagen Óptico de Acoplamiento-Osteogénesis angiogénesis para evaluar la integración de craneales hueso autoinjertos y aloinjertos
Summary
La implantación de injertos óseos autólogos y alogénicos constituyen aceptó enfoques para tratar la importante pérdida de masa ósea craneofacial. Sin embargo, el efecto de la composición de injerto en la interacción entre la neovascularización, la diferenciación celular y la formación de hueso no está claro. Se presenta un protocolo de imagen multimodal destinado a dilucidar la interdependencia angiogénesis osteogénesis en la proximidad del injerto.
Abstract
Un parámetro importante que determina el éxito de un procedimiento de injerto óseo es la vascularización de la zona que rodea el injerto. La hipótesis de que la implantación de un autoinjerto de hueso induciría una mayor regeneración ósea mediante la formación de vasos sanguíneos abundantes. Para investigar el efecto del injerto sobre la neovascularización en el sitio del defecto, hemos desarrollado un enfoque micro-tomografía computarizada (μCT) para caracterizar los vasos sanguíneos de nueva formación, lo que implica la perfusión sistémica del animal con un agente de contraste de polimerización. Este método permite el análisis detallado vascular de un órgano en su totalidad. Además, la perfusión sanguínea se evaluó a través de imágenes de fluorescencia (FLI) de un agente fluorescente transmitida por la sangre. La formación de hueso se cuantificó por FLI utilizando una sonda de hidroxiapatita de orientación y análisis μCT. Reclutamiento de células madre se siguió por imágenes de bioluminiscencia (BLI) de ratones transgénicos que expresan la luciferasa bajo el control del promotor de la osteocalcina.Aquí describimos y demostramos preparación del aloinjerto, la cirugía defecto de la bóveda craneal, los protocolos de exploración μCT para el estudio y análisis de la neovascularización la formación de hueso (incluyendo la perfusión in vivo de agente de contraste), y el protocolo para el análisis de datos.
El análisis de alta resolución 3D de la vasculatura demostró significativamente mayor angiogénesis en animales con autoinjertos implantados, especialmente con respecto a la formación arteriola. En consecuencia, la perfusión sanguínea fue significativamente mayor en el grupo de autoinjerto por el 7º día después de la cirugía. Se observó mineralización ósea superior y la formación de hueso mayor medido en animales que recibieron autoinjertos. Implantación autoinjerto residente inducida reclutamiento de células madre a la sutura ósea injerto-huésped, donde las células diferenciadas en células formadoras de hueso entre el 7 y el 10 º día postoperatorio. Este hallazgo significa que la formación de hueso mejorada puede ser atribuida ala alimentación vascular aumentada que caracteriza a la implantación autoinjerto. Los métodos presentados pueden servir como una herramienta óptima para estudiar la regeneración ósea en términos de formación de hueso bien delimitada y neovascularización.
Introduction
Pérdida de masa ósea debido a un traumatismo craneofacial, la resección del tumor, craneotomía descompresiva y defecto congénito rara vez se cura por sí mismo y presenta una clara necesidad clínica insatisfecha. Injertos óseos autólogos y alogénicos injertos óseos son ampliamente utilizados para tratar estas condiciones 1.
Es ampliamente aceptado que la osteogénesis está estrechamente unida con la angiogénesis 2,3. Por lo tanto, el estudio completo de una terapia propuesta para la regeneración ósea debe incluir una investigación exhaustiva del árbol vascular formando lo largo de todo el sitio del defecto. Hay varios métodos disponibles para caracterizar la vascularización en los modelos de investigación. El árbol vascular puede ser investigado por el análisis histológico. Desde la histología se basa en seccionar los tejidos, hay una alta probabilidad de que la imagen resultante será distorsionada. Para abordar este problema, la microscopía intravital se puede realizar para los vasos sanguíneos intactos imagen 4; Sin embargo, este método eslimitado a imágenes de un avión. μCT de exploración de especímenes obtenidos de un animal perfundido con agente de contraste permite obtener imágenes 3D de la red vascular que alimenta el sitio de regeneración 5. Este enfoque permite una manifestación muy detallada de la vasculatura de un órgano en su conjunto, así como un análisis minucioso de la distribución de los vasos sanguíneos. Además, permite la diferenciación entre μCT variados diámetros de los vasos sanguíneos, que caracterizan los diferentes subtipos de los vasos sanguíneos.
La hipótesis de que la implantación de un autoinjerto de calota inducirá una mayor neovascularización de la implantación de un injerto, y este aumento de la neovascularización dará lugar, a su vez, a los huesos mejorado formation.To perseguir esta hipótesis se empleó una variedad de técnicas. Se investigaron los patrones del árbol vascular recién formado mediante la realización de un análisis basado en μCT. Se midió la perfusión sanguínea usando una sonda fluorescente sangre piscina. A continuación, asnossed mineralización de tejido óseo por FLI de una sonda dirigida hidroxiapatita y análisis μCT. Finalmente, monitorizamos el reclutamiento de células madre y la diferenciación, la realización de BLI en ratones transgénicos en los que la luciferasa se expresa en células de osteocalcina-positivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El objetivo de los enfoques de formación de imágenes multimodales se describe aquí es para permitir meticulosa investigación del eje angiogénesis-osteogénesis en el contexto de injerto de hueso craneal. La neovascularización fue fotografiada utilizando un protocolo μCT, lo que permitió una alta resolución de demostración 3D precisa del árbol vascular alimentar todo el defecto craneal. datos μCT se pueden analizar fácilmente utilizando herramientas avanzadas como el software de IPL. Por ejemplo, el análisi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding from the NIDCR (Grant No. DE019902) and from the Israeli Science Foundation (Grant No. 382/13).
Materials
| C57BL/C Mice | Harlan laboratories | 57 | |
| FVB/n Mice | Harlan laboratories | 862 | |
| Phenobarbital | West waro | NDC 0641-0477-25 | |
| Rodent hair clipper | Wahl animal | 8786-451A | |
| Scalpel 11 | Miltex | 27111504 | |
| Dental micro motor | marathon III | ||
| 5mm trephine | Fine Science tools | 18004-50 | |
| Hair removing cream | Veet | ||
| KetaVed (Ketamine) | Vedco | NDC 50989-996-06 | |
| Domitor | Zoetis | NADA 141-267 | |
| carprofen | Norbrook | 02000/4229 | |
| Eye ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Operating binocular | Kent scientific | KSCXTS-1121 | |
| Fine scissors | Fine Science tools | 14060-11 | |
| Curve tweezers | Fine Science tools | 11274-20 | |
| Spoon shaped spatula | Fine Science tools | 10090-13 | |
| Tisseel Fibin gel kit | Baxter | 718971 | |
| needle holder | Fine Science tools | 12060-01 | |
| vicryl suture 4-0 | Ethicon | J392H | |
| Antisedan | Zoetis | NADA#141033 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| 20ml luerlock | BD | 302830 | |
| 23G scalp vein set (butterfly needle) | BD | 367342 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13008-12 | |
| Syringe pump | Harvard apparatus | PHD 2000 | |
| 3sec gel glue | Scotch | ||
| rodent dissection board | Leica | 38DI02313 | |
| Microfil MV-122 | flow-tech | MV-122 | |
| uCT40 scanner | Scanco | uCT40 | |
| TCA6% | Sigma | T6399 | |
| Osteosense 680 | PerkinElmar | NEV10020EX | |
| Angiosense750 | PerkinElmar | NEV10011 | |
| Oxigen 100% medical grade | |||
| isoflurane (furane) | Baxter | 1001936040 | |
| IVIS kinetics | Xenogen | ||
| Beetle luciferin | Promega | E160A |
References
- Finkemeier, C. G. Bone-grafting and bone-graft substitutes. J Bone Joint Surg Am. 84-A (3), 454-464 (2002).
- Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. Osteogenesis and angiogenesis: the potential for engineering bone. Eur Cell Mater. 15, 100-114 (2008).
- Schipani, E., Maes, C., Carmeliet, G., Semenza, G. L. Regulation of osteogenesis-angiogenesis coupling by HIFs and VEGF. J Bone Miner Res. 24 (8), 1347-1353 (2009).
- Huang, C., et al. Spatiotemporal Analyses of Osteogenesis and Angiogenesis via Intravital Imaging in Cranial Bone Defect. J Bone Miner Res. , (2015).
- Kimelman-Bleich, N., et al. The use of a synthetic oxygen carrier-enriched hydrogel to enhance mesenchymal stem cell-based bone formation in vivo. Biomaterials. 30 (27), 4639-4648 (2009).
- Iris, B., et al. Molecular imaging of the skeleton: quantitative real-time bioluminescence monitoring gene expression in bone repair and development. J Bone Miner Res. 18 (3), 570-578 (2003).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
- Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nat Protoc. 6 (1), 105-110 (2011).
- Fleming, J. T., et al. Bone blood flow and vascular reactivity. Cells Tissues Organs. 169 (3), 279-284 (2001).
- Dhillon, R. S., et al. PTH-enhanced structural allograft healing is associated with decreased angiopoietin-2-mediated arteriogenesis, mast cell accumulation, and fibrosis. J Bone Miner Res. 28 (3), 586-597 (2013).
- Nebuloni, L., Kuhn, G. A., Vogel, J., Muller, R. A. A novel in vivo vascular imaging approach for hierarchical quantification of vasculature using contrast enhanced micro-computed tomography. PLoS One. 9 (1), e86562 (2014).
- Zhang, X., et al. Periosteal progenitor cell fate in segmental cortical bone graft transplantations: implications for functional tissue engineering. J Bone Miner Res. 20 (12), 2124-2137 (2005).
- Movahed, R., Pinto, L. P., Morales-Ryan, C., Allen, W. R., Wolford, L. M. Application of cranial bone grafts for reconstruction of maxillofacial deformities. Proc (Bayl Univ Med Cent). 26 (3), 252-255 (2013).
- Putters, T. F., Schortinghuis, J., Vissink, A., Raghoebar, G. M. A prospective study on the morbidity resulting from calvarial bone harvesting for intraoral reconstruction. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Kline, R. M., Wolfe, S. A. Complications associated with the harvesting of cranial bone grafts. Plast Reconstr Surg. 95 (1), 5-13 (1995).
- Hassanein, A. H., et al. Effect of calvarial burring on resorption of onlay cranial bone graft. J Craniofac Surg. 23 (5), 1495-1498 (2012).
- Yin, J., Jiang, Y. Completely resorption of autologous skull flap after orthotopic transplantation: a case report. Int J Clin Exp Med. 7 (4), 1169-1171 (2014).
- Schuss, P., et al. Bone flap resorption: risk factors for the development of a long-term complication following cranioplasty after decompressive craniectomy. J Neurotrauma. 30 (2), 91-95 (2013).
- Ben Arav, A., et al. Adeno-associated virus-coated allografts: a novel approach for cranioplasty. J Tissue Eng Regen Med. 6 (10), e43-e50 (2012).
- Ito, H., et al. Remodeling of cortical bone allografts mediated by adherent rAAV-RANKL and VEGF gene therapy. Nat Med. 11 (3), 291-297 (2005).
- Sheyn, D., et al. PTH promotes allograft integration in a calvarial bone defect. Mol Pharm. 10 (12), 4462-4471 (2013).
- Jain, R. K. Molecular regulation of vessel maturation. Nat Med. 9 (6), 685-693 (2003).
- Reginato, S., Gianni-Barrera, R., Banfi, A. Taming of the wild vessel: promoting vessel stabilization for safe therapeutic angiogenesis. Biochem Soc Trans. 39 (6), 1654-1658 (2011).
- Moutsatsos, I. K., et al. Exogenously regulated stem cell-mediated gene therapy for bone regeneration. Mol Ther. 3 (4), 449-461 (2001).
- Deckers, M. M., et al. Bone morphogenetic proteins stimulate angiogenesis through osteoblast-derived vascular endothelial growth factor. A. Endocrinology. 143 (4), 1545-1553 (2002).
- Cornejo, A., et al. Effect of adipose tissue-derived osteogenic and endothelial cells on bone allograft osteogenesis and vascularization in critical-sized calvarial defects. Tissue Eng Part A. 18 (15-16), 1552-1561 (2012).
