유전적으로 암호화된 전압 지표를 사용하여 막 전위의 변화를 이미징하는 방법에 대해 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
유전자 인코딩 전압 표시기(GEVI)는 생체 내 기록에 유용하기 시작하는 지점까지 개선되었습니다. 궁극적인 목표는 in vivo 뉴런 활동을 이미지화하는 것이지만, 성공적인 in vivo 준비를 보장하기 위해서는 단일 세포의 활동을 이미지화할 수 있어야 합니다. 이 절차는 단일 세포에서 막 전위를 이미지화하여 최종적으로 in vivo에서 이미지화할 수 있는 기반을 제공하는 방법을 설명합니다. 여기에서는 단일 형광 단백질(FP) 또는 체외에서 Förster 공명 에너지 전달(FRET)이 가능한 두 개의 형광 단백질에 융합된 전압 감지 도메인으로 구성된 GEVI를 이미징하는 방법에 대해 설명합니다. 이미지 스플리터를 사용하면 두 개의 서로 다른 파장에서 생성된 이미지를 동일한 CCD(전하 결합 소자) 카메라에 동시에 투사할 수 있습니다. 이미지 분할기는 광 경로에 두 번째 필터 큐브를 배치합니다. 이 두 번째 필터 큐브는 GEVI의 FP에 따라 donor 및 acceptor 형광 파장을 분리하기 위해 dichroic filter와 two emission filter로 구성됩니다. 이 설정을 통해 수용체와 공여체 형광 파트너를 동시에 기록할 수 있으며, 멤브레인 전위는 전체 세포 패치 클램프 구성을 통해 조작됩니다. 단일 FP로 구성된 GEVI를 사용할 때 두 번째 필터 큐브를 제거하여 이미지 스플리터의 미러가 단일 이미지를 CCD 카메라에 투사할 수 있습니다.
서론
본 연구의 주요 초점은 유전자 코드 형광 단백질을 이용하여 시험관 내에서 막 전위 변화 결상을 입증하는 것이다. 막 전위의 이미지 변화는 신경 회로의 활동을 연구의 흥미로운 가능성을 제공합니다. 형광 강도의 변화에 따라서 막 전위 변화는 카메라의 각 화소는 비 침입 신경 활성의 측정을 가능하게되면 서로 게이트 전극. 40 년의 경우, 유기 전압에 민감한 염료는 1-4 잠재적 인 멤브레인의 변화를 관찰하는 데 유용되고있다. 그러나, 이들 염료는 세포 특이성이 부족하다. 또한, 일부 세포 유형은 염색하기 어렵다. 유전자 인코딩 된 전압 지표 (GEVIs)는 세포가 구체적으로 연구 형광 전압에 민감한 프로브를 표현하는 데 이러한 한계를 극복.
GEVIs의 세 가지 클래스가 있습니다. GEVI의 첫 번째 클래스는 VO를 사용단일 형광 단백질 (FP) 5-9이나 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 쌍 10-12 중 하나와 전압 센싱 포스파타제 도메인에서 전 압을 감지. 센서의 두 번째 클래스는 형광 표시 직접적으로 13-15로 또는 전기 FRET (16, 17)를 통해 미생물 로돕신을 사용합니다. 세 번째 클래스는 두 개의 구성 ....
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프로토콜
윤리 문 : 동물 실험 프로토콜은 KIST 동물 프로토콜 2014-001에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다.
1. 장비 설치
- 영상 설정
- 진동 절연 테이블에 거꾸로 형광 현미경을 놓습니다. 대물 렌즈와 전압 이미징에 사용하기에 적합한 형광 단백질 다이크로 익 미러와 필터를 구비 한 필터 큐브 (1.35 개구 수 60X 오일 침지 렌즈)를 사용하여 고배율.
주 :이 설치 높은 NA와 사용 목적을 위해 거꾸로 현미경을 사용하지만, 수직 현미경을 사용할 수도있다. 높은 개구 수 (NA)의 대물 렌즈는 낮은 NA함으로써 잡음비 (SNR에 신호를 향상으로보다 많은 빛을 수집 때문에 실제로 도립 현미경은 단지 프로브 개발이다 나눈 피크 광 신호로서 설명 될 수있다 기준의 표준 편차기록 형광). 비 개발자를 위해, 우리는 조각이나 생체 내 녹음에서 응용 프로그램의 직립 현미경을 추천 할 것입니다. - 광원을 준비 예., 크세논 아크 램프, 효율적인 표면 형광 넓은 필드 이미징 기계 셔터를 구비. 마운트 광 가이드를 통해 현미경으로 빛을 직접. 광 여기 필터를 통과하며 필터 큐브 제 다이크로 익 미러에 의해 반사된다. 보기 (21)의<....
- 진동 절연 테이블에 거꾸로 형광 현미경을 놓습니다. 대물 렌즈와 전압 이미징에 사용하기에 적합한 형광 단백질 다이크로 익 미러와 필터를 구비 한 필터 큐브 (1.35 개구 수 60X 오일 침지 렌즈)를 사용하여 고배율.
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결과
일시적으로 형질 감염된 세포는 크게 형광 강도의 변화 및 세포막 발현의 정도를 나타낼 수있다. 심지어 같은 coverslip에 일부 세포는 내부 형광의 다양한 수준을 제공합니다. 이는 세포에 의해 흡수 형질 제의 양 가장 쉽다. 때때로 너무 많이 발현이 세포 사멸 (27)의 결과로 펼쳐진 단백질 응답을 체험 할 수있는 세포 발생 (밝은, 높은 내부 형광, 세포를 반올림). 실험 따라서 내부 식 잡음비 (SNR)에 신호를 저하 무응답 형광을 생성 이후 가능한 한 적은 내부 형광 밝은 세포 희미 세포 모두를 테스트 할주의한다.
또 다른 고려 사항은 그림 3. 발색단의 성숙 속도 인 수용체 chromoph의 형광에서 차이를 보여줍니다공여 발색단 (클로버)보다 긴 숙성 시간이 광석 (mRuby2).
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토론
신경 조직은 여러 가지 방법으로 전압이 약간 억제 과분극가 시냅스 입력이 비교적 큰 전압 변화에 약간의 탈분극 및 활동 전위 결과 발생 원인 이용한다. GEVIs하여 막 전위의 변화를 측정 할 수 동시에 신경 회로의 여러 구성 요소를 분석 유망한 잠재력을 제공한다. 이 보고서에서 우리는 GEVIs를 사용하여 막 전위의 이미지 변화를위한 기본적인 방법을 보여줍니다.
전압 이미징 변경 주요 키 세포막에서 GEVI의 효율적인 표현이다. 세포 내 발현은 프로브의 SNR을 감소시키는 비 형광 반응을 생성한다. 형질 전환 조건의 최적화는 크게 광 측정의 일관성을 개선한다. 소설 GEVI을 테스트 할 때 실제로, 광학 활성의 차이는 북동에 전적으로 기인 있는지 확인하는 것도 알려진 프로브를 테스트하는 것이 좋습니다w 프로브 셀없는 상태.
도 6은 전압 촬상의 감도를 감소 내부 형광의 효과를 나타낸다, ΔF .......
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공개 사항
저자는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
본 연구는 교육과학기술부 보조금 WCI 2009-003과 한국과학기술연구원 제도적 프로그램 프로젝트 2E24210의 지원을 받아 한국연구재단의 WCI(World Class Institute) 프로그램의 지원을 받았습니다. 이성무는 교육부 산하 국립연구재단(NRF)의 Global Ph.D. Fellowship 프로그램(NRF-2013H1A2A1033344)의 지원을 받았다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 반전 현미경 | Olympus | IX71 | |
| 60X 대물 렌즈 (수치 조리개 = 1.35) | Olympus | UPLSAPO 60XO | |
| 여기 필터 | Semrock | FF02-472/30 | 의 초 황도 pHluorin의 전압 이미징 용 |
| FF495-Di03-25x36 | |||
| 방출 필터 | Semrock | FF01-497 / LP | |
| 75W 크세논 아크 램프 | CAIRN | OptoSource Illuminator | LED 및 레이저도 효과적인 광원 |
| 속 CCD 카메라 | Hitachi | KP-D20BU | |
| 듀얼 포트 카메라 어댑터 | 올림푸스 | U-DPCAD | |
| 고속 CCD 카메라 | RedShirtImaging, LLC | NeuroCCD-SM | |
| 이미지 스플리터 | CAIRN | Optosplit 2 | |
| 여기 필터 | Semrock | FF01-475/23-25 | FRET 쌍 기반 GEVI의 전압 이미징 Clover와 mRuby2) |
| 이색성 미러 | Semrock | FF495-Di03-25x36 | |
| 방출 필터 | Chroma | ET520/40 | |
| 이색성 미러 | Semrock | FF560-FDi01-25X36 | |
| 방출 필터 | Chroma | ET645/75 | |
| 진동 차단 시스템 | 키네틱 시스템 | 250BM-IC, 5702E-3036-31 | |
| 패치 챔버 | 워너 악기 | RC-26G, 64-0235 | |
| #0 마이크로 커버 글라스 (22 x 40 mm) | 전자 현미경 과학 | 72198-20 | |
| 온도 컨트롤러 | 워너 악기 | TC-344B | |
| # 0 (0.08 ~ 0.13 mm) - 10 mm 직경 유리 커버 슬립 | Ted Pella | 260366 | |
| Lipofection agent | Life Technologies | 11668-027 | |
| 인산 칼슘 시약 | Clontech - Takara | 631312 | |
| 패치 클램프 증폭기 | HEKA | EPC 10 USB 증폭기 | |
| 다중 채널 데이터 수집 소프트웨어 | HEKA | Patchmaster | |
| 이미지 수집 및 분석 소프트웨어 | RedShirtImaging | Neuroplex | |
| 스프레드시트 응용 프로그램 소프트웨어 | Microsoft | Microsoft Excel 2010 | |
| 데이터 분석 소프트웨어 | OriginLab | OriginPro 8.6.0 | |
| Demagnifier | Qioptiq LINOS | Optem 표준 카메라 커플러 0.38x SC38 J 클램프 | |
| 컨포칼 현미경 | Nikon | Nikon A1R 컨포칼 현미경 | |
| 퇴색 방지 시약 | Life Technologies | P36930 |
참고문헌
- Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system. Nature. 246, 508-509 (1973).
- Cohen, L. B., et al. Changes in axon fluorescence during act....
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재인쇄 및 허가
