Epigenetische Umwandlung als eine sichere und einfache Methode, Insulin absondernden Zellen aus adulten Fibroblasten der Haut zu erhalten
Summary
Here, a new method that allows the conversion of adult skin fibroblasts into insulin-secreting cells is presented. This technique is based on epigenetic conversion, does not involve the use of retroviral vectors nor the acquisition of a stable pluripotent state. It is therefore highly promising for translational medicine applications.
Abstract
Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such cells are not readily available, they can be obtained using different approaches that include, among the many, reprogramming and trans-differentiation, with advantages and limitations that are specific of the different techniques. Here a new strategy for the conversion of an adult mature fibroblast into an insulin-secreting cell, arbitrarily designated as epigenetic converted cells (EpiCC), is described. The method has been developed, based on the increasing understanding of the mechanisms controlling epigenetic regulation of cell fate and differentiation. In particular, the first step uses an epigenetic modifier, namely 5-aza-cytidine, to drive adult cells into a “highly permissive” state. It then takes advantage of this brief and reversible window of epigenetic plasticity, to re-address cells toward a different lineage. The approach is designated “epigenetic cell conversion”. It is a simple and robust way to obtain an efficient, controlled and stable cellular inter-lineage switch. Since the protocol does not involve the use of any gene transfection, it is free of viral vectors and does not involve a stable pluripotent state, it is highly promising for translational medicine applications.
Introduction
Ein grundlegendes Ziel der regenerativen Medizin ist die Erzeugung von neuen, funktionsfähigen Zellen, die verwendet werden können, zu reparieren oder zu ersetzen beschädigte, entartete Gewebe. leicht verfügbar adulte Zellen in neue remaking, indem sie aus einem Zelltyp in einen anderen umzuwandeln, ist ein besonders attraktiver Ansatz, insbesondere, wenn die erforderliche Zellpopulation Zugang nicht reichlich oder schwierig ist. Allerdings sind adulte Zellen bemerkenswert stabil. Sie erhalten ihre differenzierten Zustand durch eine schrittweise Einschränkung ihrer Möglichkeiten und, sobald sie die reifen Terminal Spezialisierung erreichen, sie es stabil 1 behalten.
In den letzten Jahren haben eine Reihe von Protokollen entwickelt worden, dass die Umprogrammierung zu Pluripotenz einer somatischen Zelle (iPS) ermöglichen erreicht durch die erzwungene Expression einer ganzen Reihe von Transkriptionsfaktoren 2,3. Alternativ kann die Zellumwandlung durch direkte Abstammungslinie transdifferentiation erhalten werden, eine einzige 4 Einführung </sup> oder eine Kombination von Transkriptionsfaktoren 5-7. Diese Strategie geht es nicht um den Übergang durch eine de-differenzierten Zustand , sondern erfordert eine hohe Expression des spezifischen Transkriptionsfaktoren 8.
Wir haben kürzlich eine Umwandlungsprotokoll, das auf der kurzen Belichtungs adulter Zellen zu den demethylating Eigenschaften des Cytidinanalogon 5-Azacytidin (5-Aza-CR), einem gut charakterisierten DNA-Methyltransferase-Inhibitor entwickelt. Die Demethylierung Schritt wird sofort durch eine spezifische Differenzierungsprotokoll 9-11 gefolgt, die die erforderliche terminalen Phänotyp zu erhalten ermöglicht. Dieses Verfahren ist in der Lage reife, differenzierte Zellen in Zellen einer anderen Abstammung zu konvertieren und hat den wesentlichen Vorteil, sowohl die Verwendung von viralen Vektoren und die Transfektion einer exogenen Transkriptionsfaktoren zu vermeiden. Der Erwerb eines stabilen pluripotenten Zustand, und die damit verbundene erhöhte Anfälligkeit Instabilität der Zelle wird ebenfalls vermieden.
<p class="Jove_content"> Das detaillierte Protokoll, das die Umwandlung von adulten menschlichen Hautfibroblasten in voll funktionsfähigem insulinsezernierenden Zellen ermöglicht wird hier vorgestellt. Allerdings ist es erwähnenswert, dass die Technik auf unterschiedlichen Zelltypen angewendet wurde und führte zu positiven Ergebnissen, wenn die Zellen gegenüber verschiedenen Differenzierungswege Adressierung. Darüber hinaus hat epigenetische Umwandlung erfolgreich in der Mensch und Schwein Spezies 9-13 sowie in dem Hund (Manuskript eingereicht) was auf eine breite Wirksamkeit und Robustheit des Ansatzes verwendet.Protocol
Representative Results
Discussion
Die vorliegende Manuskript beschreibt ein Verfahren, das die Umwandlung von Fibroblasten der menschlichen Haut in Insulin-produzierende Zellen, durch eine transiente und kurze Exposition gegenüber 5-Aza-CR, gefolgt von einem gewebespezifischen Induktionsprotokoll ermöglicht. Dieser Ansatz ermöglicht einen Wechsel von Mesoderm Endoderm verwandten Zellen, ohne die erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren oder microRNAs noch den Erwerb eines stabilen pluripotenten Zustand, die 14 Zellen mehr instabil …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von Carraresi Stiftung und Europäische Stiftung für die Erforschung von Diabetes (EFSD) gefördert. GP wird von einem Post-Doc-Stipendium der Universität von Mailand unterstützt. Die Autoren sind Mitglieder der COST-Aktion FA1201 Epiconcept: Epigenetik und Periconception Umwelt und die COST Aktion BM1308 Freigabe Fortschritte auf Großtiermodellen (SALAAM). TALB ist Mitglied der COST Action CM1406 Epigenetische Chemical Biology (Epichem).
Materials
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D5652 | PBS; for cell wash and solution preparation |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| 100 mm petri dish | Sarstedt | 83.3902 | For Fibroblast isolation |
| Porcine Gelatin | Sigma | G1890 | For dish coating |
| Water | Sigma | W3500 | For solution preparation |
| 35 mm petri dishes | Sarstedt | 83.39 | For Fibroblast isolation |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 41966052 | For Fibroblast culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10500064 | FBS; Component of Fibroblast and HP media |
| L-Glutamine solution | Sigma | G7513 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | For Fibroblast dissociation |
| KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS | Hycor Biomedical | 87144 | Cell counting |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385 | 5-aza-CR, for increrase cell plasticity in fibroblasts |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Life Technologies | 31550031 | For HP medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Life Technologies | 31885023 | For HP medium |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | Component of HP medium |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life Technologies | 11140035 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| Guanosine | Sigma | G6264 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Adenosine | Sigma | A4036 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Cytidine | Sigma | C4654 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Uridine | Sigma | U3003 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Thymidine | Sigma | T1895 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Millex-GS 0,22 µm | Millipore | SLGS033SB | For sterilizing of solution |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG0261 | bFGF; Component of HP and Pancreatic Basal medium |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | BSA; Component of Pancreatic Basal medium |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320074 | For Pancreatic Basal medium |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A | Life Technologies | 12587010 | Component of Pancreatic medium |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | Component of Pancreatic Basal medium |
| Activin A Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG9014 | For Pancreatic medium |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | For Pancreatic medium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | DMSO; for Retinoic Acid stock preparation |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Life Technologies | 41400045 | ITS; for Pancreatic Final medium |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab8069 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma | 32670 | DAPI. For immunocytochemical analisys. Working dilution 1µg/ml |
| 5-Methylcytidine | Eurogentec | MMS-900P-B | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Anti-C Peptide antibody | Abcam | ab14181 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| Anti-PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Mercodia Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-10 | For insulin release detection |
References
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