Summary

Эпигенетическое преобразования как безопасный и простой метод получения секретирующих инсулин клеток из фибробластов кожи взрослых

Published: March 18, 2016
doi:

Summary

Here, a new method that allows the conversion of adult skin fibroblasts into insulin-secreting cells is presented. This technique is based on epigenetic conversion, does not involve the use of retroviral vectors nor the acquisition of a stable pluripotent state. It is therefore highly promising for translational medicine applications.

Abstract

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such cells are not readily available, they can be obtained using different approaches that include, among the many, reprogramming and trans-differentiation, with advantages and limitations that are specific of the different techniques. Here a new strategy for the conversion of an adult mature fibroblast into an insulin-secreting cell, arbitrarily designated as epigenetic converted cells (EpiCC), is described. The method has been developed, based on the increasing understanding of the mechanisms controlling epigenetic regulation of cell fate and differentiation. In particular, the first step uses an epigenetic modifier, namely 5-aza-cytidine, to drive adult cells into a “highly permissive” state. It then takes advantage of this brief and reversible window of epigenetic plasticity, to re-address cells toward a different lineage. The approach is designated “epigenetic cell conversion”. It is a simple and robust way to obtain an efficient, controlled and stable cellular inter-lineage switch. Since the protocol does not involve the use of any gene transfection, it is free of viral vectors and does not involve a stable pluripotent state, it is highly promising for translational medicine applications.

Introduction

Основной задачей регенеративной медицины является генерирование новых функциональных клеток, которые могут быть использованы для ремонта или замены поврежденного, выродились ткани. Переделка легко доступные взрослые клетки в новые, путем преобразования их из одного типа клеток в другой, является особенно привлекательным подход, особенно когда требуется популяция клеток не обильные или трудно получить доступ. Тем не менее, взрослые клетки удивительно стабильны. Они приобретают их дифференцированное состояние путем постепенного ограничения в их возможностях и, как только они достигают зрелого терминала специализации, они стабильно сохраняют его 1.

В последние годы был разработан целый ряд протоколов, которые позволяют перепрограммировать к плюрипотентности соматической клетки (ИПС) достигается за счет принудительного экспрессии набор факторов транскрипции 2,3. В качестве альтернативы, преобразование клеток может быть получена путем прямого клонального трансдифференциации, представляя один 4 </suр> или сочетание факторов транскрипции 5-7. Эта стратегия не предполагает перехода через состояние де-дифференцированы , но требует высокой экспрессии специфических транскрипционных факторов 8.

Недавно мы разработали протокол обращения на основании кратковременном воздействии взрослых клеток к свойствам деметилирующий в цитидин аналоговой 5-азацитидина (5-аза-CR), ингибитор хорошо охарактеризованного ДНК-метилтрансферазы. Стадия деметилирования немедленно следует определенному протоколу 9-11 дифференциации , что позволяет получить необходимую терминальную фенотип. Этот метод способен превратить зрелых, дифференцированных клеток в клетки различного рода и имеет существенное преимущество, чтобы избежать как использование вирусных векторов и трансфекцию любых экзогенных факторов транскрипции. Приобретение стабильного плюрипотентного состояния, и связанная с ним повышенная восприимчивость к клеточной нестабильности также избежать.

<p class="Jove_content"> Подробный протокол, который позволяет преобразование взрослых фибробластов кожи человека в полностью функциональные инсулин-секретирующих клеток представлена ​​здесь. Тем не менее, стоит отметить, что этот метод был применен к различным типам клеток и положительным результатам, при решении клеток по отношению к различным путям дифференцировки. Кроме того, эпигенетическое преобразование было успешно использовано в человеческих и свиные виды 9-13, а также у собак (рукопись представлена) предлагая широкий эффективность и надежность подхода.

Protocol

Примечание: Все процедуры, описанные ниже, должны выполняться под колпаком с ламинарным потоком в стерильных условиях. Убедитесь, что все процедуры культуры проводятся на терморегулирующие стадиях и клетки выдерживали при 37 ° C в течение их обработки. 1. Кожа Фибробласт Изоляция <ol…

Representative Results

Создание первичной культуры от биопсии кожи Биопсия кожи были вырезаны в небольших фрагментов и поместили в желатиновые чашки, предварительно покрытые. Через 6 дней, фибробласты начал расти из фрагментов ткани и образовали монослой клеток (рис 1А). Клетки …

Discussion

Настоящая рукопись описывает метод, который позволяет преобразования фибробластов кожи человека в инсулин-продуцирующие клетки, через транзиторной и кратковременного воздействия 5-аза-CR, а затем тканеспецифическому индукции протокола. Такой подход позволяет перейти от мезодермы , с?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была профинансирована Каррарези Фондом и Европейским фондом по изучению диабета (EFSD). GP поддерживается пост-Стипендия университета Милана. Авторы являются членами COST действий FA1201 Epiconcept: окружающая среда Epigenetics и Periconception и действий COST BM1308 Совместное использование надвигается на больших животных моделях (Салам). TALB является членом COST Action CM1406 Эпигенетическое химической биологии (EPICHEM).

Materials

Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma D5652 PBS; for cell wash and solution preparation
Antibiotic Antimycotic Solution Sigma A5955 Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media
100 mm petri dish Sarstedt 83.3902 For Fibroblast isolation
Porcine Gelatin Sigma G1890 For dish coating
Water Sigma W3500 For solution preparation
35 mm petri dishes Sarstedt 83.39 For Fibroblast isolation
DMEM, high glucose, pyruvate Life Technologies 41966052 For Fibroblast culture medium
Fetal Bovine Serum Life Technologies 10500064 FBS; Component of Fibroblast and HP media
L-Glutamine solution Sigma G7513 Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media
Trypsin-EDTA solution Sigma T3924 For Fibroblast dissociation
KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS Hycor Biomedical 87144 Cell counting
5-Azacytidine Sigma A2385 5-aza-CR, for increrase cell plasticity in fibroblasts
Ham's F-10 Nutrient Mix Life Technologies 31550031 For HP medium
DMEM, low glucose, pyruvate Life Technologies 31885023 For HP medium
KnockOut Serum Replacement Life Technologies 10828028 Component of HP medium
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Life Technologies 11140035 Component of HP and Pancreatic Basal media
2-Mercaptoethanol Sigma M7522 Component of HP and Pancreatic Basal media
Guanosine Sigma G6264 Nucleoside mix stock component of HP medium
Adenosine Sigma A4036 Nucleoside mix stock component of HP medium
Cytidine Sigma C4654 Nucleoside mix stock component of HP medium
Uridine Sigma U3003 Nucleoside mix stock component of HP medium
Thymidine Sigma T1895 Nucleoside mix stock component of HP medium
Millex-GS 0,22 µm Millipore SLGS033SB For sterilizing of solution
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein Life Technologies PHG0261 bFGF; Component of HP and Pancreatic Basal medium
Bovine Serum Albumin Sigma A3311 BSA; Component of Pancreatic Basal medium
DMEM/F-12 Life Technologies 11320074 For Pancreatic Basal medium
B-27 Supplement Minus Vitamin A Life Technologies 12587010 Component of Pancreatic medium
N-2 Supplement Life Technologies 17502048 Component of Pancreatic Basal medium
Activin A Recombinant Human Protein Life Technologies PHG9014 For Pancreatic medium
Retinoic Acid Sigma R2625 For Pancreatic medium
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650 DMSO; for Retinoic Acid stock preparation
Insulin-Transferrin-Selenium Life Technologies 41400045 ITS; for Pancreatic Final medium
Anti-Vimentin antibody  Abcam ab8069 For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride Sigma 32670 DAPI. For immunocytochemical analisys. Working dilution  1µg/ml
5-Methylcytidine Eurogentec MMS-900P-B For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500
Anti-C Peptide antibody  Abcam ab14181 For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100
Anti-PDX1 antibody  Abcam ab47267 For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500
Mercodia Insulin ELISA Mercodia 10-1113-10 For insulin release detection

References

  1. Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455 (7213), 627-632 (2008).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  3. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  4. Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).
  5. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  6. Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
  7. Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475, 386-389 (2011).
  8. Marro, S., et al. Direct Lineage Conversion of Terminally Differentiated Hepatocytes to Functional Neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
  9. Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8948-8953 (2013).
  10. Pennarossa, G., et al. Reprogramming of Pig Dermal Fibroblast into Insulin Secreting Cells by a Brief Exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Rev. 10 (1), 31-43 (2014).
  11. Brevini, T. A., et al. Morphological and Molecular Changes of Human Granulosa Cells Exposed to 5-Azacytidine and Addressed Toward Muscular Differentiation. Stem Cell Rev. 10 (5), 633-642 (2014).
  12. Thoma, E. C., et al. Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells. Stem Cell Reports. 3 (4), 539-547 (2014).
  13. Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell J. 17 (1), 153-158 (2015).
  14. Plath, K., Lowry, W. E. Progress in understanding reprogramming to the induced pluripotent state. Nat Rev Genet. 12 (4), 253-265 (2011).
  15. Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
  16. Glover, T. W., Coyle-Morris, J., Pearce-Birge, L., Berger, C., Gemmill, R. M. DNA demethylation induced by 5-azacytidine does not affect fragile X expression. Am J Hum Genet. 38 (3), 309-318 (1986).
  17. Do, J. T., Scholer, H. R. Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells. Stem Cells. 22 (6), 941-949 (2004).
  18. Niwa, H. How is pluripotency determined and maintained?. Development. 134 (4), 635-646 (2007).
  19. Kahan, B. W., et al. Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation. Diabetes. 52 (8), 2016-2024 (2003).

Play Video

Cite This Article
Brevini, T. A., Pennarossa, G., Maffei, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts. J. Vis. Exp. (109), e53880, doi:10.3791/53880 (2016).

View Video