Summary

Conversão epigenética como um método seguro e simples para obter células secretoras de insulina a partir de fibroblastos da pele de adultos

Published: March 18, 2016
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Summary

Here, a new method that allows the conversion of adult skin fibroblasts into insulin-secreting cells is presented. This technique is based on epigenetic conversion, does not involve the use of retroviral vectors nor the acquisition of a stable pluripotent state. It is therefore highly promising for translational medicine applications.

Abstract

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such cells are not readily available, they can be obtained using different approaches that include, among the many, reprogramming and trans-differentiation, with advantages and limitations that are specific of the different techniques. Here a new strategy for the conversion of an adult mature fibroblast into an insulin-secreting cell, arbitrarily designated as epigenetic converted cells (EpiCC), is described. The method has been developed, based on the increasing understanding of the mechanisms controlling epigenetic regulation of cell fate and differentiation. In particular, the first step uses an epigenetic modifier, namely 5-aza-cytidine, to drive adult cells into a “highly permissive” state. It then takes advantage of this brief and reversible window of epigenetic plasticity, to re-address cells toward a different lineage. The approach is designated “epigenetic cell conversion”. It is a simple and robust way to obtain an efficient, controlled and stable cellular inter-lineage switch. Since the protocol does not involve the use of any gene transfection, it is free of viral vectors and does not involve a stable pluripotent state, it is highly promising for translational medicine applications.

Introduction

Um dos objectivos fundamentais da medicina regenerativa é a geração de células novas e funcionais que podem ser utilizadas para reparar ou substituir danificado, degenerou tecidos. Refazendo células adultas facilmente disponíveis para novos, convertendo-os a partir de um tipo de célula para outra, constitui uma abordagem particularmente interessantes, especialmente quando a população de células não é necessário abundante ou de difícil acesso. No entanto, células adultas são notavelmente estáveis. Eles adquirem seu estado diferenciado através de uma restrição gradual em suas opções e, uma vez que eles atinjam a especialização de terminais maduros, eles estavelmente guarde-1.

Nos últimos anos, um número de protocolos têm sido desenvolvidos, que permitem a reprogramação para pluripotência de uma célula somática (IPS) obtida através da expressão forçada de um conjunto de factores de transcrição 2,3. Alternativamente, a conversão de células podem ser obtidas por transdiferenciação linhagem directa, a introdução de um único quatro </sup> ou uma combinação de factores de transcrição 5-7. Esta estratégia não envolve a transição através de um estado diferenciado-de, mas exige alta expressão da transcrição específica fatores 8.

Nós desenvolvemos recentemente um protocolo de conversão com base na breve exposição de células adultas para as propriedades demetilantes da citidina análogo 5-azacitidina (5-aza-CR), um inibidor da DNA metiltransferase bem caracterizado. O passo de desmetilação é imediatamente seguido por um protocolo de diferenciação específica 9-11 que permite obter o fenótipo do terminal necessária. Este método é capaz de converter as células maduras, diferenciadas em células de uma linhagem diferente e tem a vantagem substancial a fim de evitar, tanto a utilização de vectores virais e a transfecção de quaisquer factores de transcrição exógenos. A aquisição de um estado pluripotente estável, eo aumento da susceptibilidade relacionadas à célula instabilidade também é evitado.

<p class="Jove_content"> O protocolo detalhado que permite a conversão de fibroblastos da pele de seres humanos adultos em células totalmente funcionais secretoras de insulina é aqui apresentada. No entanto, é importante notar que a técnica tem sido aplicada a diferentes tipos de células e produziu resultados positivos, ao abordar células no sentido de várias vias de diferenciação. Além disso, a conversão epigenética tem sido utilizado com sucesso na espécie humana e suína 9-13, bem como no cão (manuscrito apresentado), sugerindo uma grande eficácia e robustez da abordagem.

Protocol

Nota: Todos os procedimentos descritos abaixo deve ser realizada sob capela de fluxo laminar em condições estéreis. Certifique-se de que todos os procedimentos de cultura são realizadas em etapas termóstato e as células são mantidas a 37 ° C em toda a manipulação. 1. Pele Isolamento de fibroblastos Prepare Cultura Solution Dish Coating Dissolve-se 0,1 g de gelatina porcina em 100 ml de água (concentração final 0,1%). Esterilizar solução com autoclave. Adicionar 1,5 ml…

Representative Results

Estabelecimento de cultura primária a partir de biópsias de pele As biópsias da pele foram cortados em pequenos fragmentos e colocados em pratos de gelatina pré-revestidos. Após 6 dias, os fibroblastos começou a crescer a partir dos fragmentos de tecido e formou uma monocamada de células (Figura 1A). As células apresentaram uma forma típica alongado e, como esperado, apresentou um imuno-positividade uniforme para o fibroblasto vimentina marcador específi…

Discussion

O presente manuscrito descreve um método que permite a conversão de fibroblastos de pele humana em células produtoras de insulina, por meio de uma exposição transitória e breve a 5-aza-CR, seguido por um protocolo de indução de tecido específico. Esta abordagem permite que um interruptor de mesoderme endoderme de células relacionadas, sem a expressão forçada de factores de transcrição ou microARNs nem a aquisição de um estado pluripotente estável, que torna as células mais instável e propenso a erros …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pela Fundação Carraresi e Fundação Europeia para o Estudo da Diabetes (EFSD). GP é apoiado por uma bolsa de pós-doc, da Universidade de Milão. Os autores são membros da Acção COST FA1201 Epiconcept: Epigenética e Periconception ambiente e da Acção COST BM1308 Sharing avança em modelos animais de grande porte (SALAAM). Talb é membro da Acção COST CM1406 epigenética Chemical Biology (EPICHEM).

Materials

Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma D5652 PBS; for cell wash and solution preparation
Antibiotic Antimycotic Solution Sigma A5955 Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media
100 mm petri dish Sarstedt 83.3902 For Fibroblast isolation
Porcine Gelatin Sigma G1890 For dish coating
Water Sigma W3500 For solution preparation
35 mm petri dishes Sarstedt 83.39 For Fibroblast isolation
DMEM, high glucose, pyruvate Life Technologies 41966052 For Fibroblast culture medium
Fetal Bovine Serum Life Technologies 10500064 FBS; Component of Fibroblast and HP media
L-Glutamine solution Sigma G7513 Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media
Trypsin-EDTA solution Sigma T3924 For Fibroblast dissociation
KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS Hycor Biomedical 87144 Cell counting
5-Azacytidine Sigma A2385 5-aza-CR, for increrase cell plasticity in fibroblasts
Ham's F-10 Nutrient Mix Life Technologies 31550031 For HP medium
DMEM, low glucose, pyruvate Life Technologies 31885023 For HP medium
KnockOut Serum Replacement Life Technologies 10828028 Component of HP medium
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Life Technologies 11140035 Component of HP and Pancreatic Basal media
2-Mercaptoethanol Sigma M7522 Component of HP and Pancreatic Basal media
Guanosine Sigma G6264 Nucleoside mix stock component of HP medium
Adenosine Sigma A4036 Nucleoside mix stock component of HP medium
Cytidine Sigma C4654 Nucleoside mix stock component of HP medium
Uridine Sigma U3003 Nucleoside mix stock component of HP medium
Thymidine Sigma T1895 Nucleoside mix stock component of HP medium
Millex-GS 0,22 µm Millipore SLGS033SB For sterilizing of solution
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein Life Technologies PHG0261 bFGF; Component of HP and Pancreatic Basal medium
Bovine Serum Albumin Sigma A3311 BSA; Component of Pancreatic Basal medium
DMEM/F-12 Life Technologies 11320074 For Pancreatic Basal medium
B-27 Supplement Minus Vitamin A Life Technologies 12587010 Component of Pancreatic medium
N-2 Supplement Life Technologies 17502048 Component of Pancreatic Basal medium
Activin A Recombinant Human Protein Life Technologies PHG9014 For Pancreatic medium
Retinoic Acid Sigma R2625 For Pancreatic medium
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650 DMSO; for Retinoic Acid stock preparation
Insulin-Transferrin-Selenium Life Technologies 41400045 ITS; for Pancreatic Final medium
Anti-Vimentin antibody  Abcam ab8069 For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride Sigma 32670 DAPI. For immunocytochemical analisys. Working dilution  1µg/ml
5-Methylcytidine Eurogentec MMS-900P-B For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500
Anti-C Peptide antibody  Abcam ab14181 For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100
Anti-PDX1 antibody  Abcam ab47267 For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500
Mercodia Insulin ELISA Mercodia 10-1113-10 For insulin release detection

References

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Cite This Article
Brevini, T. A., Pennarossa, G., Maffei, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts. J. Vis. Exp. (109), e53880, doi:10.3791/53880 (2016).

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