Summary

מרת אפיגנטיים כאמצעי בטוח ופשוט להשיג תאי מפרישי אינסולין פיברובלסטים עור בוגרים

Published: March 18, 2016
doi:

Summary

Here, a new method that allows the conversion of adult skin fibroblasts into insulin-secreting cells is presented. This technique is based on epigenetic conversion, does not involve the use of retroviral vectors nor the acquisition of a stable pluripotent state. It is therefore highly promising for translational medicine applications.

Abstract

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such cells are not readily available, they can be obtained using different approaches that include, among the many, reprogramming and trans-differentiation, with advantages and limitations that are specific of the different techniques. Here a new strategy for the conversion of an adult mature fibroblast into an insulin-secreting cell, arbitrarily designated as epigenetic converted cells (EpiCC), is described. The method has been developed, based on the increasing understanding of the mechanisms controlling epigenetic regulation of cell fate and differentiation. In particular, the first step uses an epigenetic modifier, namely 5-aza-cytidine, to drive adult cells into a “highly permissive” state. It then takes advantage of this brief and reversible window of epigenetic plasticity, to re-address cells toward a different lineage. The approach is designated “epigenetic cell conversion”. It is a simple and robust way to obtain an efficient, controlled and stable cellular inter-lineage switch. Since the protocol does not involve the use of any gene transfection, it is free of viral vectors and does not involve a stable pluripotent state, it is highly promising for translational medicine applications.

Introduction

מטרה בסיסית של רפואה רגנרטיבית הוא הדור של תאים חדשים, פונקציונלי, שניתן להשתמש בהם כדי לתקן או להחליף פגום, הידרדר רקמות. Remaking תאי בוגרים זמינים בקלות לתוך חדש, על ידי המרה אותם סוג תא אחד למשנו, היא גישה במיוחד מושכת, במיוחד כאשר אוכלוסיית התא הנדרשת אינה שופעת או קשה לגישה. עם זאת, תאים בוגרים הם יציב להפליא. הם רוכשים מדינת הבדיל שלהם באמצעות הגבלה הדרגתית האפשרויות שלהם, ברגע שהם מגיעים התמחות המסוף הבוגרת, הם ביציבות לשמור אותו 1.

בשנים האחרונות במספר הפרוטוקולים פותחו, המאפשרות תכנות מחדש מגוונת" של תא סומטי (שב"ס) מושג באמצעות הביטוי הכפוי של סט של שעתוק גורמי 2,3. לחלופין, מרת תא ניתן להשיג על ידי transdifferentiation שושלת הישיר, מציגה אחת 4 </su p> או שילוב של שעתוק גורמי 5-7. אסטרטגיה זו אינה כרוכה במעבר דרך מדינת בדיל-דה אבל דורשת ביטוי גבוה של השעתוק הספציפי גורמי 8.

פתחנו לאחרונה פרוטוקול המרה המבוסס על החשיפה הקצרה של תאי בוגרי מאפייני demethylating של-azacytidine 5 cytidine האנלוגי (5-עז-CR), מעכב methyltransferase DNA היטב מאופיין. הצעד demethylation ומיד אחריו פרוטוקול התמיינות ספציפית 9-11 המאפשר להשיג את הפנוטיפ מסוף נדרש. שיטה זו היא מסוגלת להמיר תאים בוגרים, בדיל לתוך תאים של באים ממשפחות שונות ויש לו את היתרון המשמעותי כדי למנוע הוא את שימוש וקטורים ויראליים ואת transfection של כל גורמי שעתוק אקסוגניים. הרכישה של מדינת pluripotent יציבה, ואת הרגישות המוגברת הקשורים לתא חוסר יציבות הוא נמנע גם.

<p class="Jove_content"> הפרוטוקול המפורט מאפשר המרה של פיברובלסטים עור אנושיים בוגרים לתאי אינסולין מפריש מתפקדים במלואה מוצג כאן. עם זאת, ראוי לציין כי הטכניקה יושמה תאים מסוגים שונים יצרה תוצאות חיוביות, כאשר הם פונים תאים כלפי מסלולי בידול שונים. יתר על כן, מרת אפיגנטיים נוצלה בעבר בהצלחת המין האנושי חזירי 9-13 וכן את הכלב (כתב יד) שנמסר המצביע על יעילות וחוסנם רחבות של הגישה.

Protocol

הערה: כל הנהלים המתוארים להלן חייב להתבצע מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית בתנאים סטריליים. ודא כי כל הליכי התרבות מבוצעים על במות נשלטו תרמוסטטית ותאים נשמרים על 37 מעלות צלזיוס לאורך כל הטיפול שלהם. 1. עור בידוד פיברובלסטים <ol style=";text-align:right;dir…

Representative Results

הקמת התרבות העיקרית ביופסיות עור ביופסיות עור נחתכו שברים קטנים והניחו במנות ג'לטין מצופים מראש. לאחר 6 ימים, פיברובלסטים התחילו לצמוח מתוך שברי הרקמה ויצרו monolayer תא (איור 1 א). תאים הראו צורה מאורכת טיפוסית, כצפוי, הפגינו חיסונית-חיובי?…

Discussion

כתב היד הנוכחי מתארת ​​שיטה מאפשרת המרה של פיברובלסטים עור אנושיים לתוך תאים מייצרי אינסולין, באמצעות חשיפה חולפת וקצרה עד 5-עז-CR, ואחריו פרוטוקול אינדוקצית רקמות ספציפי. גישה זו מאפשרת מעבר מ mesoderm לתאים הקשורים endoderm, ללא ביטוי בכפייה של גורמי שעתוק או מיקרו-רנ"א ו…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי קרן Carraresi והאירופי קרן לחקר הסוכרת (EFSD). GP הוא נתמך על ידי מענק פוסט-דוקטורט מאוניברסיטת מילאנו. הכותבים הם חברי פעולת COST FA1201 Epiconcept: סביבת אפיגנטיקה Periconception ואת פעולת COST BM1308 שיתוף מקדם על מודלים של בעלי חיים גדולים (סלאם). טאלב הוא חבר ביולוגית עלות פעולת CM1406 אפיגנטיים הכימי (EPICHEM).

Materials

Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma D5652 PBS; for cell wash and solution preparation
Antibiotic Antimycotic Solution Sigma A5955 Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media
100 mm petri dish Sarstedt 83.3902 For Fibroblast isolation
Porcine Gelatin Sigma G1890 For dish coating
Water Sigma W3500 For solution preparation
35 mm petri dishes Sarstedt 83.39 For Fibroblast isolation
DMEM, high glucose, pyruvate Life Technologies 41966052 For Fibroblast culture medium
Fetal Bovine Serum Life Technologies 10500064 FBS; Component of Fibroblast and HP media
L-Glutamine solution Sigma G7513 Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media
Trypsin-EDTA solution Sigma T3924 For Fibroblast dissociation
KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS Hycor Biomedical 87144 Cell counting
5-Azacytidine Sigma A2385 5-aza-CR, for increrase cell plasticity in fibroblasts
Ham's F-10 Nutrient Mix Life Technologies 31550031 For HP medium
DMEM, low glucose, pyruvate Life Technologies 31885023 For HP medium
KnockOut Serum Replacement Life Technologies 10828028 Component of HP medium
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Life Technologies 11140035 Component of HP and Pancreatic Basal media
2-Mercaptoethanol Sigma M7522 Component of HP and Pancreatic Basal media
Guanosine Sigma G6264 Nucleoside mix stock component of HP medium
Adenosine Sigma A4036 Nucleoside mix stock component of HP medium
Cytidine Sigma C4654 Nucleoside mix stock component of HP medium
Uridine Sigma U3003 Nucleoside mix stock component of HP medium
Thymidine Sigma T1895 Nucleoside mix stock component of HP medium
Millex-GS 0,22 µm Millipore SLGS033SB For sterilizing of solution
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein Life Technologies PHG0261 bFGF; Component of HP and Pancreatic Basal medium
Bovine Serum Albumin Sigma A3311 BSA; Component of Pancreatic Basal medium
DMEM/F-12 Life Technologies 11320074 For Pancreatic Basal medium
B-27 Supplement Minus Vitamin A Life Technologies 12587010 Component of Pancreatic medium
N-2 Supplement Life Technologies 17502048 Component of Pancreatic Basal medium
Activin A Recombinant Human Protein Life Technologies PHG9014 For Pancreatic medium
Retinoic Acid Sigma R2625 For Pancreatic medium
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650 DMSO; for Retinoic Acid stock preparation
Insulin-Transferrin-Selenium Life Technologies 41400045 ITS; for Pancreatic Final medium
Anti-Vimentin antibody  Abcam ab8069 For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride Sigma 32670 DAPI. For immunocytochemical analisys. Working dilution  1µg/ml
5-Methylcytidine Eurogentec MMS-900P-B For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500
Anti-C Peptide antibody  Abcam ab14181 For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100
Anti-PDX1 antibody  Abcam ab47267 For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500
Mercodia Insulin ELISA Mercodia 10-1113-10 For insulin release detection

References

  1. Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455 (7213), 627-632 (2008).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  3. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  4. Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).
  5. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  6. Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
  7. Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475, 386-389 (2011).
  8. Marro, S., et al. Direct Lineage Conversion of Terminally Differentiated Hepatocytes to Functional Neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
  9. Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8948-8953 (2013).
  10. Pennarossa, G., et al. Reprogramming of Pig Dermal Fibroblast into Insulin Secreting Cells by a Brief Exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Rev. 10 (1), 31-43 (2014).
  11. Brevini, T. A., et al. Morphological and Molecular Changes of Human Granulosa Cells Exposed to 5-Azacytidine and Addressed Toward Muscular Differentiation. Stem Cell Rev. 10 (5), 633-642 (2014).
  12. Thoma, E. C., et al. Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells. Stem Cell Reports. 3 (4), 539-547 (2014).
  13. Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell J. 17 (1), 153-158 (2015).
  14. Plath, K., Lowry, W. E. Progress in understanding reprogramming to the induced pluripotent state. Nat Rev Genet. 12 (4), 253-265 (2011).
  15. Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
  16. Glover, T. W., Coyle-Morris, J., Pearce-Birge, L., Berger, C., Gemmill, R. M. DNA demethylation induced by 5-azacytidine does not affect fragile X expression. Am J Hum Genet. 38 (3), 309-318 (1986).
  17. Do, J. T., Scholer, H. R. Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells. Stem Cells. 22 (6), 941-949 (2004).
  18. Niwa, H. How is pluripotency determined and maintained?. Development. 134 (4), 635-646 (2007).
  19. Kahan, B. W., et al. Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation. Diabetes. 52 (8), 2016-2024 (2003).

Play Video

Cite This Article
Brevini, T. A., Pennarossa, G., Maffei, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts. J. Vis. Exp. (109), e53880, doi:10.3791/53880 (2016).

View Video