Die Differenzierung der Atrial Kardiomyozyten aus pluripotenten Stammzellen Mit dem BMP-Antagonisten Grem2
Summary
Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.
Abstract
Protokolle für die Populationen von Kardiomyozyten aus pluripotenten Stammzellen zu erzeugen, wurden entwickelt, aber diese in der Regel Zellen aus gemischten Phänotypen ergeben. Die Forscher interessiert Studien führen spezifische myocyte Subtypen Beteiligung erfordern eine gerichtete Differenzierung Ansatz. Durch die Behandlung kann Maus embryonale Stammzellen (ES – Zellen) mit Grem2, sezerniertes BMP – Antagonist, für die atriale Kammerbildung in vivo erforderlich ist, eine große Anzahl von Herzzellen mit einem atrial – Phänotyp erzeugt werden. Verwendung des konstruierten Myh6-DsRed-Nuc pluripotenten Stammzelllinie ermöglicht die Identifizierung, Selektion und Reinigung von Kardiomyozyten. In diesem Protokoll werden Embryoidkörpern von Myh6-DsRed-Nuc Zellen erzeugt, um die hängenden Tropfen Verfahren und in der Schwebe gehalten, bis die Differenzierung Tag 4 (d4) verwendet wird. Bei d4 Zellen werden mit Grem2 behandelt und plattiert auf Gelatine-beschichteten Platten. Zwischen d8-d10 großen öffentlichen Flächen in den Kulturen beobachtet werden und weiter expandieren und mAture durch d14. Molekular-, histologische und electrophysiogical Analysen zeigen Zellen in Grem2 behandelten Zellen atrial artigen Eigenschaften eine in – vitro – Modell die Bereitstellung zur Untersuchung der Biologie des atrialen Kardiomyozyten und ihre Reaktion auf verschiedene pharmakologische Mittel zu erwerben.
Introduction
Pluripotente Stammzellen sind ein leistungsfähiges Werkzeug zum Erzeugen und Zellen aus einer Vielzahl von schwer zugänglichen Geweben für Grundlagenforschung und präklinische Studien, insbesondere beim Menschen 1-5 studieren. Die richtige Modulation der Entwicklungs-Signalwege können die Differenzierung pluripotenter Stammzellen auf die gewünschte phänotypische Schicksal lenken. Viele Protokolle wurden entwickelt , Kardiomyozyten (CMs) aus pluripotenten Stammzellen 6-14 zu erzeugen. Diese Protokolle umfassen im allgemeinen Modulation TFGβ -Superfamilie (Activin, BMP und TGF & bgr;) und Wnt Wege durch timed Zugabe von exogenen Wachstumsfaktoren und / oder kleine Moleküle 10,12-15. Diese Protokolle sind im allgemeinen wirksam bei der der Prozentsatz der Zellen zu erhöhen, die CMs werden, aber es fehlt die Spezifität, eine gemischte Population von Zellen zu erzeugen darstellt atrialen, ventrikulären und Knoten / Leitungssystem Abstammungen. Um bestimmte Herz zu studieren Subtypen eine gerichtete Differenzierung approACH ist nicht erforderlich.
Gremlin2 (Grem2, die auch als Protein mit Bezug zu Dan und Cerberus oder PRDC kurz) ist ein sezerniertes BMP – Antagonist, der für die richtige Herzdifferenzierung und Vorhofkammer Bildung während der Herzentwicklung in Zebrabärbling 16 notwendig ist. Die Behandlung von Differenzierung embryonaler Stammzellen mit Grem2 an Differenzierung Tag 4, kurz nach Spitzen Expression von mesodermalen Marker T-Brachyurie und Cerberus wie 1, erhöht die Ausbeute an CMs und erzeugt einen Pool von Zellen überwiegend aus der Vorhof Linie 14.
Rekombinante Grem2 wird verwendet , um die differenzierenden Zellen zu behandeln und kann 17 unter Verwendung von Standard – Protein – Produktionstechniken hergestellt werden oder können im Handel erworben werden. Es ist in wässrigen Lösungen sehr gut löslich und können exogen zu Kulturen mit der gewünschten Zeitpunkt zugesetzt werden.
Die Differenzierung kann mittels RT-qPCR quantifiziert werden verfolgt Expression von Markern repräsentativvon Herz-Kreislauf-Vorläufern, Herz-Vorläufern und engagierte CMs. Immunofluoreszenz können auch zur Identifizierung und Visualisierung der räumlichen Verteilung der kardialen Zelltypen verwendet werden.
Anwendungen, die reine Populationen erfordern, werden leichter durchgeführt, wenn ein Reportersystem mit CMs zu identifizieren und zu isolieren. Zu diesem Zweck haben wir die & alpha; MHC-DsRedNuc Konstrukts in die Maus CGR8 ES – Zelllinie 14 eingeführt. CGR8 Zellen wachsen und bleiben pluripotent ohne Feeder – Zellen, Expansion und Differenzierung Assays zu erleichtern 18. Die ES – Zelllinie enthält eine DsRed – fluoreszierende Protein codierende Sequenz mit einem Kernlokalisierungssignal unter der herzspezifischen alpha – Myosin schwere Kette (& agr; MHC- oder Myh6) Genpromotor. Unter Verwendung dieser Zellen kann CMs leicht zur Quantifizierung identifiziert und isoliert werden, Zellsortierung, Elektrophysiologie, Drogen-Bildschirme, und Mechanismen der atrial Differenzierung zu studieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll erzeugt routinemßig Kulturen mit einem hohen Prozentsatz der CMs, die charakteristisch für die atriale lineage sind. Wie bei jeder Differenzierung Protokoll sollte die Qualität der mESCs vor der Differenzierung besondere Aufmerksamkeit geschenkt werden. mESCs sollten routinemäßig für die richtige Morphologie (Abbildung 1A) überwacht werden. Jede spontane Differenzierung , die vor der Bildung von EBs auftritt , wird stark die Effizienz der Kardiogenese begrenzen und sollte vor der…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
": Training in Untersuchungsprogramm in Herz-Kreislauf-Mechanismen" (JB) Diese Arbeit wurde durch NIH Zuschüsse HL083958 und HL100398 (AKH) und 2T32HL007411-33 unterstützt.
Materials
| GMEM | Life Technologies | 11710 | |
| FBS | Life Technologies | 10082 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Non-Essential Amino Acids | Sigma | M7145 | |
| 10 cm Tissue Culture Plates | Sarstedt | 83.3902 | |
| 10 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-342 | |
| 6 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-092 | |
| 6-well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3920 | |
| Gremlin 2 recombinant protein | R&D Systems | 2069-PR-050 | |
| Sterile filter units | Thermo Fisher | 09-741-02 | |
| Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | |
| 10X PBS, Sterile | Sigma | P5493 | |
| BSA | Sigma | 5470 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | Life Technologies | 25300054 | |
| DPBS, no Calcium, no Magnesium | Life Technologies | 14200 |
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