Дифференциация мерцательной кардиомиоцитов из плюрипотентных стволовых клеток Используя BMP антагонистов Grem2
Summary
Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.
Abstract
Протоколы для генерации популяции кардиомиоцитов из плюрипотентных стволовых клеток, были разработаны, но они обычно дают клетки смешанных фенотипов. Исследователи, заинтересованные в проведении исследований с участием конкретных миоцитов подтипов требуют более направленной дифференцировки подход. Обрабатывая мышиных эмбриональных стволовых (ЭС) клеток со Grem2, секретируемого антагониста BMP , который необходим для формирования мерцательной камеры в естественных условиях, большое количество клеток сердца с мерцательной фенотипа может быть сгенерирован. Использование сконструированной Myh6-DsRed-Nuc плюрипотентные линии стволовых клеток позволяет идентифицировать, отбора и очистки кардиомиоцитов. В этом протоколе эмбриональные органы формируются из клеток Myh6-DsRed-NUC с использованием метода висящий капли и выдерживают в суспензии до дифференцировки день 4 (d4). В d4 клетки обрабатывают Grem2 и высевают на покрытые желатином пластин. Между d8-d10 крупные подрядные участки наблюдаются в культурах и продолжают расширяться и мратура через D14. Молекулярный, гистологические и electrophysiogical анализы показывают клетки в Grem2-обработанных клеток приобретают предсердные подобные характеристики , обеспечивающие модель в пробирке для изучения биологии предсердных кардиомиоцитов и их реакцию на различных фармакологических агентов.
Introduction
Плюрипотентные стволовые клетки являются мощным инструментом для создания и изучения клетки от хозяина трудно тканей доступа для фундаментальных исследований и доклинических исследований, особенно у людей 1-5. Правильная модуляция развития путей передачи сигналов может направлять дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток к желаемой фенотипической судьбы. Многие протоколы были разработаны для создания кардиомиоцитов (КМВ) из плюрипотентных стволовых клеток 6-14. Эти протоколы обычно включают в себя модуляцию TFGβ надсемейство (активин, BMP и TGF – beta) и Wnt путей распространения приурочено добавления экзогенных факторов роста и / или малых молекул 10,12-15. Эти протоколы, как правило, эффективны при увеличении процента клеток, которые становятся КМВ, но не имеют специфичности, создавая смешанную популяцию клеток, представляющих предсердий, желудочков, и система узловой / проводимости родословных. Для изучения конкретных кардиологические подтипы более направленной дифференцировки APPROACH требуется.
Gremlin2 (Grem2, называемый также протеин , относящиеся к Дэну и Cerberus или PRDC для краткости) представляет собой секретируемый антагонист BMP , который необходим для правильной сердечной дифференциации и формирования мерцательной камеры во время остановки развития в данио 16. Лечение дифференцирующие эмбриональных стволовых клеток с Grem2 при разграничении 4 -й день, сразу после пика экспрессии мезодермальных маркеров Т-Brachyury и Cerberus , как 1, увеличивает выход КМВ и формирует пул клеток преимущественно предсердия линии 14.
Рекомбинантный Grem2 используется для лечения дифференцирующие клетки и могут быть изготовлены с использованием технологии производства стандартного белка 17 или могут быть приобретены на коммерческой основе . Он хорошо растворим в водных растворах и могут быть добавлены к экзогенно культур в желаемый момент времени.
Разграничение можно отслеживать с помощью RT-КПЦР для количественного определения экспрессии маркеров представителясердечно-сосудистых клеток-предшественников, сердечные клетки-предшественники, совершенные CMs. Иммунофлуоресценции также могут быть использованы для идентификации и визуализации пространственного распределения сердечных типов клеток.
Приложения, которые требуют чистых популяций более легко осуществляется при использовании репортерной системы для идентификации и выделения CMs. Для этого мы ввели αMHC-DsRedNuc построить в клеточную линию мышей CGR8 ES 14. CGR8 клетки растут и остаются плюрипотентные без фидерных клеток, что способствует расширению и дифференциации анализов 18. Клеточная линия ES содержит флуоресцентный белок DsRed кодирующую последовательность с сигналом ядерной локализации при сердечной суммарной альфа тяжелой цепи миозина (альфа MHC или Myh6) , промотор гена. Используя эти клетки, КМВ можно легко идентифицировать и выделить для количественной оценки, сортировки клеток, электрофизиологии, экраны наркотиков, а также изучения механизмов мерцательной дифференциации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол обычно производит культур с высоким процентом CMs, которые характерны межпредсердной линии. Как и в случае с любым протоколом дифференциации, качество mESCs предшествующих дифференциации следует уделять особое внимание. mESCs необходимо регулярно контролировать для правильн…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH гранты HL083958 и HL100398 (АХ) и 2T32HL007411-33 "Программа в Сердечно-сосудистые механизмы: Обучение в расследовании" (JB).
Materials
| GMEM | Life Technologies | 11710 | |
| FBS | Life Technologies | 10082 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Non-Essential Amino Acids | Sigma | M7145 | |
| 10 cm Tissue Culture Plates | Sarstedt | 83.3902 | |
| 10 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-342 | |
| 6 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-092 | |
| 6-well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3920 | |
| Gremlin 2 recombinant protein | R&D Systems | 2069-PR-050 | |
| Sterile filter units | Thermo Fisher | 09-741-02 | |
| Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | |
| 10X PBS, Sterile | Sigma | P5493 | |
| BSA | Sigma | 5470 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | Life Technologies | 25300054 | |
| DPBS, no Calcium, no Magnesium | Life Technologies | 14200 |
References
- Loya, K., Eggenschwiler, R., et al. Hepatic differentiation of pluripotent stem cells. Biological Chemistry. 390 (10), 1047-1055 (2009).
- Narazaki, G., Uosaki, H., et al. Directed and systematic differentiation of cardiovascular cells from mouse induced pluripotent stem cells. Circulation. 118 (5), 498-506 (2008).
- Zhang, Y., Pak, C., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations. Reproduction. 140 (1), 3-9 (2010).
- Boheler, K. R., Czyz, J., Tweedie, D., Yang, H. T., Anisimov, S. V., Wobus, A. M. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells Into cardiomyocytes. Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).
- Burridge, P. W., Anderson, D., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
- Cai, C. L., Liang, X., et al. Isl1 Identifies a cardiac progenitor population that proliferates prior to differentiation and contributes a majority of cells to the heart. Developmental Cell. 5 (6), 877-889 (2003).
- Fujiwara, M., Yan, P., et al. Induction and enhancement of cardiac cell differentiation from mouse and human induced pluripotent stem cells with Cyclosporin-A. PLoS ONE. 6 (2), e16734 (2011).
- Rai, M., Walthall, J. M., Hu, J., Hatzopoulos, A. K. Continuous antagonism by Dkk1 counter activates canonical wnt signaling and promotes cardiomyocyte differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells and Development. (1), 54-66 (2012).
- Burridge, P. W., Matsa, E., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Lian, X., Zhang, J., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Tanwar, V., Bylund, J. B., et al. Gremlin 2 promotes differentiation of embryonic stem cells to atrial fate by activation of the JNK signaling pathway. Stem Cells. 32 (7), 1774-1788 (2014).
- Kattman, S. J., Witty, A. D., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Müller, I. I., Melville, D. B., et al. Functional modeling in zebrafish demonstrates that the atrial-fibrillation-associated gene GREM2 regulates cardiac laterality, cardiomyocyte differentiation and atrial rhythm. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 332-341 (2013).
- Kattamuri, C., Luedeke, D. M., Thompson, T. B. Expression and purification of recombinant protein related to DAN and cerberus (PRDC). Protein Expression and Purification. 82 (2), 389-395 (2012).
- Schulz, H., Kolde, R., et al. The FunGenES Database: A genomics resource for mouse embryonic stem cell differentiation. PLoS ONE. 4 (9), e6804 (2009).
- . Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using Real-Time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Beck, H., Semisch, M., Culmsee, C., Plesnila, N., Hatzopoulos, A. K. Egr-1 regulates expression of the glial scar component phosphacan in astrocytes after experimental stroke. American Journal of Pathology. 173 (1), 77-92 (2008).
- Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Sachinidis, A., Fleischmann, B. K., Kolossov, E., Wartenberg, M., Sauer, H., Hescheler, J. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 862-869 (1995).
- Höpfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Volume 2: molecular embryo analysis, live imaging, transgenesis, and cloning. Methods in Molecular Biology. , 254-279 (2004).
- Ao, A., Williams, C. H., Hao, J., Hong, C. C. Modified mouse embryonic stem cell based assay for quantifying cardiogenic Induction Efficiency. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Antonchuk, J., Gassmann, M., Desbaillets, I. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWell™ plates. Basic Cell Culture Protocols. 946, 523-533 (2013).
- Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells. Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).
