Diferenciação de Atrial Cardiomyocytes de células-tronco pluripotentes Usando o BMP Antagonista Grem2
Summary
Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.
Abstract
Protocolos para a produção de populações de cardiomiócitos a partir de células estaminais pluripotentes têm sido desenvolvidos, mas estes em geral produzem fenótipos de células misturadas. Os pesquisadores interessados em prosseguir estudos envolvendo subtipos miócitos específicas requerem uma abordagem diferenciação mais direcionado. Por tratamento de células estaminais embrionárias de ratinho (ES) com Grem2, um antagonista de BMP segregada que é necessário para a formação da câmara atrial in vivo, um grande número de células cardíacas com um fenótipo fibrilação pode ser gerado. A utilização da linha de células estaminais pluripotentes engenharia Myh6-DsRED-Nuc permite a identificação, selecção e purificação de cardiomiócitos. Neste protocolo de corpos embrióides são geradas a partir de células-Myh6 DsRED-Nuc, utilizando o método de gota suspensa e mantido em suspensão até ao dia diferenciação 4 (D4). Em células D4 são tratados com Grem2 e plaqueadas em placas revestidas com gelatina. Entre D8-D10 grandes áreas contratantes são observados nas culturas e continuar a expandir e mAture através d14. Molecular, as análises histológicas e electrophysiogical indicam células em células tratadas com Grem2 adquirir características atriais-como fornecendo um modelo in vitro para estudar a biologia dos cardiomiócitos atriais e a sua resposta aos vários agentes farmacológicos.
Introduction
As células estaminais pluripotentes são uma ferramenta poderosa para gerar e estudar as células de um hospedeiro de difícil acesso aos tecidos para estudos de investigação básica e pré-clínicos, especialmente em seres humanos 1-5. modulação correcta de vias de sinalização de desenvolvimento podem dirigir a diferenciação de células estaminais pluripotentes para o destino fenotípica desejada. Muitos protocolos têm sido desenvolvidos para gerar cardiomiócitos (CMS) a partir de células estaminais pluripotentes 6-14. Estes protocolos geralmente envolvem a modulação da superfamília TFGβ (Activina, BMP e TGF-p) e percursos através de adição atempada de factores exógenos de crescimento e / ou pequenas moléculas 10,12-15 Wnt. Estes protocolos são geralmente eficazes no aumento da percentagem de células que se tornam CMS, mas carecem de especificidade, produção de uma população mista de células que representam linhagens atrial, ventricular, e sistema nodal / condução. A fim de estudar cardíaca específica subtipos A appro diferenciação mais direcionadoACH é necessária.
Gremlin2 (Grem2, também chamada proteína relacionada com Dan e Cerberus ou CRS para o short) é um antagonista secretado BMP que é necessário para a diferenciação cardíaca adequada e formação de câmara atrial durante o desenvolvimento cardíaco em zebrafish 16. Tratar a diferenciação de células estaminais embrionárias com Grem2 diferenciação no dia 4, imediatamente depois do pico de expressão dos marcadores de mesodermal t-brachyury e Cerberus como 1, aumenta o rendimento de CMS e gera um conjunto de células predominantemente da linhagem auricular 14.
Grem2 recombinante é utilizado para tratar as células de diferenciação e pode ser feita usando técnicas de produção de proteínas padrão 17 ou podem ser adquiridos comercialmente. É altamente solúvel em soluções aquosas e pode ser adicionado exogenamente para culturas no ponto de tempo desejado.
A diferenciação pode ser rastreado usando RT-qPCR para quantificar a expressão de um representante marcadoresde progenitores cardiovasculares, progenitores cardíacos e comprometido CMs. Imunofluorescência também pode ser utilizado para identificar e visualizar a distribuição espacial dos tipos de células cardíacas.
As aplicações que requerem populações puras são mais facilmente realizado quando se utiliza um sistema repórter para identificar e isolar CMS. Para esse efeito, nós introduzimos a αMHC-DsRedNuc construir na linha de células de rato CGR8 ES 14. CGR8 células pluripotentes permanecem crescer e sem células alimentadoras, facilitando de expansão e de diferenciação 18 ensaios. A linha de células ES contém uma sequência de codificação de proteína fluorescente DsRed com um sinal de localização nuclear sob a alfa-específico cardíaco Miosina Cadeia Pesada (a Mhc ou Myh6) promotor do gene. Usando essas células, o CMS pode ser facilmente identificado e isolado para a quantificação, separação de células, eletrofisiologia, telas de drogas, e estudando mecanismos de diferenciação atrial.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo rotineiramente produz culturas com uma elevada percentagem de CMS que são característicos da linhagem atrial. Como acontece com qualquer protocolo de diferenciação, a qualidade dos mESCs anteriores à diferenciação deve ser dada especial atenção. mESCs devem ser monitorizados por rotina para a morfologia adequada (Figura 1A). Qualquer diferenciação espontânea que ocorre antes da formação da EBS irá limitar severamente a eficiência de CARDIOGENESIS e deve ser removido antes …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo NIH concede HL083958 e HL100398 (AKH) e 2T32HL007411-33 "Programa em Mecanismos Cardiovasculares: Formação em Investigação" (JB).
Materials
| GMEM | Life Technologies | 11710 | |
| FBS | Life Technologies | 10082 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Non-Essential Amino Acids | Sigma | M7145 | |
| 10 cm Tissue Culture Plates | Sarstedt | 83.3902 | |
| 10 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-342 | |
| 6 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-092 | |
| 6-well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3920 | |
| Gremlin 2 recombinant protein | R&D Systems | 2069-PR-050 | |
| Sterile filter units | Thermo Fisher | 09-741-02 | |
| Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | |
| 10X PBS, Sterile | Sigma | P5493 | |
| BSA | Sigma | 5470 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | Life Technologies | 25300054 | |
| DPBS, no Calcium, no Magnesium | Life Technologies | 14200 |
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