BMP rakip GREM2 kullanma Pluripotent Kök Hücreleri Atriyal kardiyomiyositlerde Farklılaşma
Summary
Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.
Abstract
pluripotent kök hücrelerinden kardiyomiyositlerinin popülasyonlarının oluşturmak için protokoller geliştirilmiştir, ancak bunlar genellikle karışık fenotip hücreleri verim. Belirli miyosit alt tiplerinin yer aldığı çalışmalarına devam ilgilenen araştırmacılar, daha yönlendirilmiş farklılaşma yaklaşımı gerektirir. GREM2, in vivo olarak atriyal odacıktan oluşumu için gerekli olan bir eden sekrete edilmiş BMP antagonist fare embriyonik kök (ES) hücreleri tedavi olarak, atriyal fenotip ile kalp hücreleri, çok sayıda üretilebilir. işlenmiş Myh6-DsRed-Nuc pluripotent kök hücre çizgisinin teşhisinde kullanılan, seçim ve kardiyomiyositlerde saflaştırılması için izin verir. Bu protokolde embriyoid organları asılı damla yöntemiyle Myh6-DsRed-Nuc hücrelerinden üretilir ve farklılaşma 4. günde (d4) kadar süspansiyon içinde tutulması. d4 hücre GREM2 ile muamele edilir ve jelatin kaplı plakalara kaplanmıştır. d8-d10 büyük müteahhitlik alanlarında kültürlerde gözlemlenen ve genişletmeye devam m olan ArasındaD14 ile çalıçtırdıgınızda. Moleküler, histolojik ve electrophysiogical analizler GREM2 ile muamele edilmiş hücrelerdeki hücre atriyal kardiyomiyositlerin biyoloji ve çeşitli farmakolojik maddeler tepkilerini üzerinde çalışmak için in vitro bir model sağlayan, atriyal benzeri özellikler elde etmektedir.
Introduction
Pluripotent kök hücreleri oluşturma ve özellikle insanlarda 1-5, Temel araştırma ve ön-klinik çalışmalar için erişim doku zor bir ana hücreleri incelemek için güçlü araçlardır. gelişimsel sinyal yollarının düzgün modülasyon arzu edilen fenotipik kaderine pluripotent kök hücrelerin farklılaşması yönlendirebilirsiniz. Birçok protokol pluripotent kök hücreler 6-14 den kardiyomiyositlerde (CMS) oluşturmak için geliştirilmiştir. Bu protokoller, genellikle TFGβ süper ailesinin (Aktivin, BMP ve TGFβ) ve Wnt eksojen büyüme faktörleri ve / ya da küçük moleküllerin 10,12-15 zaman ayarlı eklenmesiyle yolları modülasyonunu içerir. Bu protokoller CMS haline hücrelerin yüzdesi artan genellikle etkilidir, ancak atriyal, ventriküler, ve düğüm / iletim sistemi soy temsil hücrelerin oluşan karışık bir nüfus üreten, özgüllük yoksundur. Belirli kardiyak incelemek için bir daha yönlendirilmiş farklılaşma beğenme alt tipleriach gereklidir.
Gremlin2 (Dan ve kısa Cerberus ve PRDC İlişkin GREM2 olarak da adlandırılan protein) zebrabalıkları 16 kardiyak gelişimi sırasında uygun bir kardiyak farklılaşma ve atriyal odacıktan oluşumu için gerekli olan bir eden sekrete edilmiş BMP antagonistidir. Sadece mezodermal belirteçleri T Brachyury ve 1 gibi Cerberus pik ifadesinden sonra, farklılaşma 4. günde GREM2 farklılaşan embriyonik kök hücreleri tedavi CMS verimini artırır ve ağırlıklı olarak atriyal soy 14 hücre havuzu oluşturur.
Rekombinant GREM2 farklılaşan hücrelerin tedavi etmek için kullanılır ve standart bir protein üretim teknikleri 17 kullanılarak yapılabilir veya ticari olarak satın alınabilir. Bu sulu çözeltiler içinde yüksek derecede çözünür olan ve istenen bir zaman noktasında kültürlere eksogen olarak ilave edilebilir.
Farklılaşma markörleri temsilcisi ekspresyonunu ölçmek için RT-qPCR kullanılarak izlenebilirkardiyovasküler ataları, kalp atalarıdır ve taahhüt CMS. Immünofloresans tespit etmek ve kardiyak hücre tipleri dağılımını görselleştirmek için kullanılabilmektedir.
belirlemek ve CMS izole etmek için bir raportör sistemi kullanırken saf nüfusu gerektiren uygulamalar daha kolay yapılır. Bu amaçla, αMHC-DsRedNuc fare CGR8 ES hücre hattı 14 içine inşa oluşturduk. CGR8 hücreleri genişleme ve farklılaşma deneyleri 18 kolaylaştırılması, büyümeye ve besleyici hücreler olmadan pluripotent kalır. ES hücre soyu gen promoteri (MHC ya Myh6 a) kardiyak spesifik alfa miyozin ağır zincir altında nükleer lokalizasyon sinyali ile DsRed floresan proteini kodlama dizisini içerir. Bu hücreleri kullanılarak, CM'ler kolayca tespit ve ölçümü, hücre sıralama, elektrofizyoloji, ilaç ekranlar ve atriyal farklılaşma mekanizmaları çalışmak için izole edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol rutin atriyal soyunun karakteristik CM'ler yüksek bir yüzde ile kültürleri üretmektedir. herhangi bir farklılaşma protokolü ile olduğu gibi, farklılaşma öncesi mESCs kalitesi özellikle önem verilmelidir. mESCs rutin uygun morfoloji (Şekil 1A) için izlenmelidir. Önce EBS oluşumuna oluşan herhangi bir spontan farklılaşma ciddi cardiogenesis etkinliğini sınırlamak ve (Şekil 1B) Pasajlanması önce çıkarılmalıdır. EB boyutu da cardiogenesis etki…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH hibe HL083958 ve HL100398 (AKH) ve 2T32HL007411-33 tarafından desteklenen "Kardiyovasküler Mekanizmaları Programı: Soruşturmasında Eğitimi" (JB).
Materials
| GMEM | Life Technologies | 11710 | |
| FBS | Life Technologies | 10082 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Non-Essential Amino Acids | Sigma | M7145 | |
| 10 cm Tissue Culture Plates | Sarstedt | 83.3902 | |
| 10 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-342 | |
| 6 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-092 | |
| 6-well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3920 | |
| Gremlin 2 recombinant protein | R&D Systems | 2069-PR-050 | |
| Sterile filter units | Thermo Fisher | 09-741-02 | |
| Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | |
| 10X PBS, Sterile | Sigma | P5493 | |
| BSA | Sigma | 5470 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | Life Technologies | 25300054 | |
| DPBS, no Calcium, no Magnesium | Life Technologies | 14200 |
References
- Loya, K., Eggenschwiler, R., et al. Hepatic differentiation of pluripotent stem cells. Biological Chemistry. 390 (10), 1047-1055 (2009).
- Narazaki, G., Uosaki, H., et al. Directed and systematic differentiation of cardiovascular cells from mouse induced pluripotent stem cells. Circulation. 118 (5), 498-506 (2008).
- Zhang, Y., Pak, C., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations. Reproduction. 140 (1), 3-9 (2010).
- Boheler, K. R., Czyz, J., Tweedie, D., Yang, H. T., Anisimov, S. V., Wobus, A. M. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells Into cardiomyocytes. Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).
- Burridge, P. W., Anderson, D., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
- Cai, C. L., Liang, X., et al. Isl1 Identifies a cardiac progenitor population that proliferates prior to differentiation and contributes a majority of cells to the heart. Developmental Cell. 5 (6), 877-889 (2003).
- Fujiwara, M., Yan, P., et al. Induction and enhancement of cardiac cell differentiation from mouse and human induced pluripotent stem cells with Cyclosporin-A. PLoS ONE. 6 (2), e16734 (2011).
- Rai, M., Walthall, J. M., Hu, J., Hatzopoulos, A. K. Continuous antagonism by Dkk1 counter activates canonical wnt signaling and promotes cardiomyocyte differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells and Development. (1), 54-66 (2012).
- Burridge, P. W., Matsa, E., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Lian, X., Zhang, J., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Tanwar, V., Bylund, J. B., et al. Gremlin 2 promotes differentiation of embryonic stem cells to atrial fate by activation of the JNK signaling pathway. Stem Cells. 32 (7), 1774-1788 (2014).
- Kattman, S. J., Witty, A. D., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Müller, I. I., Melville, D. B., et al. Functional modeling in zebrafish demonstrates that the atrial-fibrillation-associated gene GREM2 regulates cardiac laterality, cardiomyocyte differentiation and atrial rhythm. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 332-341 (2013).
- Kattamuri, C., Luedeke, D. M., Thompson, T. B. Expression and purification of recombinant protein related to DAN and cerberus (PRDC). Protein Expression and Purification. 82 (2), 389-395 (2012).
- Schulz, H., Kolde, R., et al. The FunGenES Database: A genomics resource for mouse embryonic stem cell differentiation. PLoS ONE. 4 (9), e6804 (2009).
- . Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using Real-Time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Beck, H., Semisch, M., Culmsee, C., Plesnila, N., Hatzopoulos, A. K. Egr-1 regulates expression of the glial scar component phosphacan in astrocytes after experimental stroke. American Journal of Pathology. 173 (1), 77-92 (2008).
- Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Sachinidis, A., Fleischmann, B. K., Kolossov, E., Wartenberg, M., Sauer, H., Hescheler, J. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 862-869 (1995).
- Höpfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Volume 2: molecular embryo analysis, live imaging, transgenesis, and cloning. Methods in Molecular Biology. , 254-279 (2004).
- Ao, A., Williams, C. H., Hao, J., Hong, C. C. Modified mouse embryonic stem cell based assay for quantifying cardiogenic Induction Efficiency. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Antonchuk, J., Gassmann, M., Desbaillets, I. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWell™ plates. Basic Cell Culture Protocols. 946, 523-533 (2013).
- Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells. Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).
