Med hjälp av en lamineringsteknik att utföra konfokalmikroskopi av Human Sclera

Abstract

Sklera är en tät bindväv som täcker och skyddar ögat. Den består huvudsakligen av täta kollagenknippen (typ I, III, IV, V, VI och VII). På grund av dess autofluorescens, opacitet, och tjocklek, har det inte befunnits lämplig för konfokalmikroskopi. Ett alternativt tillvägagångssätt till det som presenteras här, som använder formalinfixerade sklera inbäddad i paraffin för immunohistokemi, har tekniska utmaningar, speciellt när förvärmning av vävnad för antigenåtervinning. Eftersom sklera är relativt dålig i båda cellerna och fartyg, var användningen av större vävnadsprover undersökas för att hjälpa till att förhindra utsikt celler och för att förstå deras lokalisering i förhållande till fartyg och andra anatomiska ställen. För att möjliggöra för analys av större vävnadsprover under konfokalmikroskop, var en lamineringsteknik utförs för att skapa tunna skikt från sklera. Efter analys av resultaten av CD31 blodkärl och lymfkärl endothelial hyaluRonan receptor 1 (LYVE1) positiva celler, för vilka godkännande för vetenskaplig undersökning erhölls, fördelar och begränsningar av denna metod diskuteras.

Introduction

Sklera är det styva yttre skiktet som täcker ögat, som är gjord av tät bindväv. Det bidrar till att skydda intraokulära strukturer och för att upprätthålla det intraokulära trycket. Således är sklera viktigt för tydlig vision. Det saknar lymfkärl ^1,2 och därigenom bildar en yttre lymfatiska fritt gränsen mellan den och det lymfatiska fria inre öga ^3-7. Det ger också fästställen för extraokulära muskler, och därigenom dela anatomiska likheter med senor. Eftersom sklera består huvudsakligen av täta knippen av kollagen typ I och har mindre antal kollagentyper III, IV, V, VI, VIII ^8,9 och elastin ^10,11, är denna vävnad inte lätt att använda för immunohistokemi.

Anatomiskt kan sklera separeras i tre huvudskikt: (1) den ytliga vaskulariserad episclera, som finns på undersidan av bindhinnan och Tenons kapsel och mot sidorna och the bakre delen av ögat mot omloppsbana; (2) den sklerala stroma, den huvudsakliga delen av sklera; och (3) lamina fusca, som är en tunn, pigmenterat skikt som ligger direkt ovanför uvea. Vår anatomiska kunskaper om sklera härrör huvudsakligen från första hälften av ^20-talet. På den tiden, forskare studerat anatomi kärl främst genom att använda tusch injektioner ¹² och vaskulär gjutning ^13-15. Senare blev det forskat i angiografiska studier ^16-19.

Sedan dess har äldre tekniker förbättrats och nya har utvecklats som har tillåtit oss att komplettera tidigare anatomiska kunskaper. Till exempel har det bara varit ungefär ett decennium sedan vi har haft sådana tillförlitliga lymfatiska markörer som lymfatiska kärlendotel specifik hyaluronan receptor-1 (LYVE1) ²⁰ eller podoplanin ^21. Konfokalmikroskopi erbjuder nya möjligheter för att studera de anatomiska egenskaperna hos olika tiFRÅGOR i ögat. Det gör det möjligt för flera fläckar som skall användas för att differentiera markörer för celler eller för att lokalisera celler i relation till blodkärlen och andra anatomiska strukturer. Den ger en översikt när provet är av en större storlek och ger oss möjlighet att skanna igenom ett prov när på jakt efter en specifik celltyp. Med Z-stack teknik kan konfokalmikroskopi användas för prover upp till 100-200 um. Sklera skiljer sig i tjocklek mellan 0,3 mm bakom muskelfästen och 1 mm vid den bakre stolpen ^11. På grund av både sin tjocklek och opacitet, är sklera inte lämplig för konfokalmikroskopi med hjälp av traditionella metoder.

För att råda bot på detta har sklerala vävnader laminerade för att möjliggöra deras analys med konfokalmikroskopi. Denna teknik är användbar för att få en bättre förståelse för både fysiologiska och patologiska situationer i människo sklera.

Protocol

Användningen av mänskliga vävnader skall granskas och godkännas av en Institutional Review Board eller motsvarande. Det arbete som beskrivs här har godkänts av lokala etiska kommittén och hade godkännande för vetenskaplig granskning. Arbetet utfördes enligt Helsingforsdeklarationen. De humana sklerala prover erhölls från ögon globe givare (max obduktion tid 24 timmar) vid ögonbank för avdelningen för oftalmologi vid universitetet i Köln, Tyskland.

1. Experimentell Beredning

1. Förbered 96% etanol och fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i olika rör. Förbereda de primära antikropparna i den rekommenderade spädningen av PBS innehållande 2% bovint serumalbumin (BSA) och hålla alla lösningar på is. Förbered 100 l per prov.
2. Rengör alla instrument och använda skarpa skalpeller. Efter upprepad kapning med samma skalpell, ändra skalpell.
3. Skaffa 1-2 Colibri pincett, raka mikro dissekera sax, en # 10 skalpelleller ögon skalpell mikro fjäder, och fyra 26 G nålar.
4. Linda aluminiumfolie runt en polystyren platta eller använda en kork platta för att fästa vävnaden. Arbetet under en kikare stereomikroskop. Arbeta sterilt under ett laminärt luftflöde om det behövs.

2. Förbered sklera

1. Håll försiktigt glödlampan och utföra en perforerings trepanation på corneoscleral delen, vrid sedan TREPANERA. Vrid TREPANERA noggrant och jämnt på ytan för att utföra en lika runda cut. Använd en 15,5 mm storlek TREPANERA. Skär de återstående bilagor med böjd sax. Ta bort corneoscleral trepanation. Detta kommer att resultera i en anteriort öppnat glödlampa.
   1. Sätt sklera på en bomullstopp med den öppna delen uppåt. Ta näthinnan och uvea, med hjälp av colibri pincett för att dra bort båda lagren (näthinnan och uvea) från sklera. Låt inte den pigmente uvea på inner sklera. Använd böjd sax för att ta bort näthinnan och uvea från papillen. Avlägsna remaining bindhinnan, extraokulära muskler och Tenons kapsel från den ytliga sklera.
2. Ta bort den sklerala provet i önskad storlek genom att använda rak-typ sax och de colibri pincett. Ta ca 2 cm ² stora sklerala prover från olika platser. På grund av den lilla storleken, håll sklera försiktigt och klipp ut önskad storlek som fyrkanter med hjälp av rak typ sax. Den corneoscleral trepanation definierar den främre marginalen för de sklerala prover.
   1. Undvika upprepad gripa tag med pincetten som det område där vävnaden gripit är inte lämplig för konfokal mikroskopi analyser. Förbered erforderligt antal prover beroende på vilken typ experiment (t.ex. anteriort mot posteriort, jämför figur 1) och mängden antikroppar som används.
3. Sätta proverna i 1,5 ml rör för senare användning. Fixera proverna i 1,5 ml 96% etanol under 15 min, och sedan tvätta dem tre gånger vardera under 5 mini 1,5 ml PBS på shaker. Om man arbetar med frusen vävnad, utföra detta steg innan snäpp frysning.
4. Använd färsk vävnad. Men om detta inte är möjligt, snap frysa sklera i flytande kväve och hålla den vid -20 ° C för senare användning. Om man arbetar med frusen vävnad, tina före användning. Undvik upprepad upptining och frysning cykler.
5. Hålla varje prov i PBS innehållande 1,5 ml 5% BSA vid rumstemperatur under 2 h. Detta steg framkallar en svullnad av provet som är till hjälp för laminering och även förhindrar ospecifik bindning.
6. Efter proven har svällt, förbereda sklerala rutor för laminering. Arbeta under ett mikroskop, t.ex. ett binokulärt stereomikroskop. Anbringa de bakre sklerala proverna till polystyren membranet in i aluminiumfolie eller korkplattan med de 26 G nålar.
7. Böja kanterna på nålarna så att de inte stör synfältet under mikroskop.
8. Laminera full tjocklek skleral samples.
   1. Först hålla den främre skleral kanten med colibri pincett. Skär sedan försiktigt ett tunt skikt av den ytliga sklera med hjälp av # 10 skalpell, ögon skalpell mikro fjäder, eller en spatel. Håll skalpell horisontellt och skär det ytliga skiktet så tunt som möjligt från det underliggande skiktet.
   2. Dissekera ett tunt skleral lager från den sklerala torget. Denna metod är jämförbar med kirurgiska standardtekniker för att bereda en klaff under trabekulektomi och bör resultera i 30 till 80 ^ m tjocka skikt (jämför figur 2).
9. Förhindra uttorkning av sklera genom tillsats av små mängder av PBS till vävnaden, t ex 50 | il PBS med användning av en pipett.
10. Sätta de skurna lager i 100 pl PBS i 96-brunnars platta och märka både orienteringen (mot extern och intern) och skiktet (ytlig och djup), t.ex. med en vattentät färg.
11. Upprepa steg 2,7-2,9 tills vävnaden är helt lamin. </ Li>

3. Utför Immunohistokemi

1. Tillsätt 100 pl av de nödvändiga primära antikroppar i den rekommenderade spädningen. Här, till exempel använda CD 31 (monoklonal mus anti-human) och LYVE1 antikropp (kanin-anti-human), både i en utspädning av 1: 100 i PBS (innehållande 2% BSA) och inkubera vid 4 ° C över natten. Att ändra mediet i 96 brunnar, håll pipetten till väggen i brunnen och ta bort vätskan.
2. Nästa dag, tvätta proverna tre gånger vardera under 5 minuter med 200 till 300 | j, l PBS på skakapparaten. Tillsätt 100 | il av de motsvarande sekundära antikroppar; här använder get-anti-mus fluoresceinisotiocyanat (FITC) och get-anti kanin cyaninfärgämnen 3 (Cy3), och inkubera proverna vid rumstemperatur under 1-2 h. Späd de sekundära antikropparna 1: 300 i PBS innehållande 2% getserum.
3. Skölj proverna igen tre gånger vardera under 5 minuter i 200-300 pl PBS på shaker.
4. Utföra nukleär färgning, t.ex.
5. Överför proverna på objektglas, bädda in dem i 1-2 droppar fluorescerande monteringsmedium, lägga till en täck, försegla den genom att täcka kanterna med transparent lack, och förvara vid 4 ° C för senare användning eller direkt undersöka bilderna med konfokala mikroskop.
6. Använd ett konfokalmikroskop (eller motsvarande) för att analysera proverna. Använd önskad förstoring, t.ex. 10-40X förstoring.
7. Att kontrollera tjockleken av proverna, mäta med konfokalmikroskopi med hjälp av Z-Stacks. Mängden möjliga sklerala sektioner beror på placeringen av sklera, som tjockleken skiljer sig ekvatorial och baktill (jämför inledningen).

Representative Results

I representativa experiment som utförs här, det finns påvisbara fördelarna med att använda denna speciella lamineringsteknik. Det första experimentet visar de olika nätverk av episklerala blodkärls plexus i tre representativa bilder (Figur 3). Fartygen är positiva för CD31.

Det andra experimentet visar immunceller, i synnerhet LYVE1 + celler i episclera och deras förhållande till de positiva blodkärl CD31. Här Z-stack teknik användes vid 10x förstoring för att söka igenom vävnaden och förstå tredimensionella relationer blodkärl och immunceller (Figur 4).

Sklera, såväl som de bifogade extraokulära muskler, kan analyseras med avseende på närvaro av blodkärl eller immunceller. Figur 5 visarLYVE1 positiva celler och CD31 positiva blodkärl.

Figur 1:.. Schematisk bild av det mänskliga ögat Här är en schematisk bild av tvärsnittet av det mänskliga ögat Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2:. Schematisk bild av lamineringsteknik Sklera noggrant hålls med colibri pincett och lamin till fina skikt med hjälp av en skalpell. Upprepa detta steg leder till tunna vävnads bilder som kan användas för konfokalmikroskopi. Klicka god här för att se en större version av denna figur.

Figur 3:. Episklerala Blood Vessel Plexus, immunopositiva för CD31 A och B är härledda från den främre episclera, medan C är från den bakre läge. Skala bar indikerar 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4:. CD31 + blodkärl och LYVE1 + celler i en z-stack och visar Anatomiska förbindelser mellan dem Små båtar och större kan överlappa varandra. Skala bar indikerar 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: Inneslutna i sklera är extraokulära Muscles De innehåller en liknande fin blodkärl nätverk och vissa LYVE1 + celler.. Skala bar indikerar 200 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Laminering av det humana sklera är en metod för utförande av konfokalmikroskopi på denna vävnad. Ett kritiskt steg i denna process är användningen av etanol i stället för formalin för att fästa vävnaden. Enligt vår erfarenhet, erhålles bättre resultat vid användning av etanol i stället för formalin för fixering. Trubbiga skalp förvärra det förfarande och bör undvikas. På liknande sätt bör uttorkningen av sklera undvikas, eftersom det komplicerar proceduren och minskar kvaliteten på bilderna.

När det gäller immunhistokemisk färgning, kan andra antikroppar än de som tillämpas här användas. I allmänhet visar kollagen mer auto-fluorescens och bakgrund i den gröna kanalen, alltså röd, blå, och långt röda kanaler visar bättre resultat med mindre bakgrund.

Det finns emellertid flera begränsningar av tekniken. Laminering av sklera kräver en hel del övning, eftersom det är en mikro ingrepp som utförs under en Microscopen. Eftersom denna teknik utförs manuellt, de enskilda laminerade skivor är inte exakt samma storlek och skiljer sig i sin tjocklek inom en bit vävnad. Att ha vävnader exakt samma storlek, kanske trepanation vara ett alternativ, även om tjockleken på lagren kommer fortfarande att variera. För att uppnå en exakt definierad tjocklek för den sklerala sektioner, kan en automatiserad mikrokeratomanordningen vara ett alternativ för framtida experiment. Om laminering genomföres med lager som är för tjock, kan täck slide flytta ut, och vävnaden kan potentiellt torka ut. De exakta gränserna mellan episclera och stroma kan vara svårt att skilja när lamellerna utförs.

Trots detta, laminera sklera har flera fördelar i användningen av immunohistokemi, särskilt jämfört med formalinfixerad paraffininbäddad immunohistokemi, vilket är standardmetoden i den nuvarande kliniska situationen. Laminering av sklera medger konfokala Microscopiera som skall utföras, större storlek områden av sklera som skall analyseras, olika skikt av sklera som skall undersökas, liksom screening och scanning av vävnaden. I motsats, när man arbetar med formalinfixerade paraffininbäddade prover, ändrar sklera sin konsekvens i ett föga sätt under förvärmning för antigenåtervinning. Under hela uppvärmningsprocessen, kollagenfibrerna skrumpna och vävnaden förlorar kontakten med sliden. Tidigare har fartyget plexus i episclera bara varit synlig genom angiografiska tekniker eller i hela Mount View, men inte i tvärsektioner.

Förutom de tekniska svårigheter är sklera relativt avaskulära och relativt dålig i immunceller i förhållande till andra vävnader i ögat, såsom näthinnan. Därför vid användning av formalinfixerade paraffininbäddade bilder, som vanligtvis 4 pm tjocka, flera bilder behövs för att detektera positiva celler i sklera. Nyligen visade det sig att använda denna laminating teknik som den mänskliga sklera är inte acellulärt, men innehåller massor av LYVE1 + makrofager att samlas runt blodkärlen ^1.

För att sammanfatta, utföra konfokalmikroskopi på laminerade sklerala sektioner är ett lovande verktyg för att undersöka patologiska störningar i framtiden, såsom sklerit, uveit, eller trauma.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96% ethanol	Merck Chemicals, Darmstadt, Germany	P075.4
binocular stereo microscope	Motic, Hongkong, China	n.a
26 G needles	Terumo, Leuven, Belgium	303800
15.5 mm trepan	Geuder, Heidelberg, Germany	n.a
no.10 scalpel	Feather, pfm medical, Osaka, Japan	2E+08
ophthalmic scalpel micro feather	Feather, pfm medical, Osaka, Japan	no. 7657BR
CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human)	Dako, USA	IR610
LYVE1 antibody  (polyclonal rabbit anti human)	Zytomed, Germany	RBK014-05
goat anti mouse FITC antibody	Sigma Aldrich, Steinheim, Germany	F0257
goat anti rabbit Cy3 antibody	Dianova, Germany	111-165-003
Goat Serum normal	Dako, Glostrup, Denmark	X090710-8
DAPI	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	6335.1
microscope slides	Engelbrecht, Edermünde, Germany	WC7695002
Coverslips 24 mm x 24 mm	Th. Gayer, Lohmar, Germany	7695026
DAKO fluorescent mounting medium	DAKO, USA	S3023
LSM Meta 510 confocal microscopy	Carl Zeiss AG, Jena, Germany	n.a