Abstract
למרות ההתקדמות בהבנת הראש קרצינומה תאים קשקשיים הצוואר (HNSCC) התקדמות, שיעור הישרדות של חמש שנים נותרה נמוכה בשל הישנות מקומית גרורות מרוחקות. השערה אחת להסביר הישנות זה היא הנוכחות של תאי גזע דמוי סרטן (CSCS) שמציגים chemo- מובנה וסיכון-התנגדות רדיו. על מנת לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות, יש צורך יש דגמים ניסיוניים המאמתים את היעילות של טיפולים ממוקדים ולכן יש שיטות אמינות לזיהוי והבידוד של CSCS. לשם כך, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד של CSCS שורות תאי HNSCC אדם מסתמך על השילוב של שני sortings תא הרצוף מבוצע על ידי תא מופעל קרינת מיון (FACS). האחת מבוססת על הנכס של CSCS כדי overexpress ATP-כריכה קלטת (ABC) חלבונים טרנספורטר ובכך לכלול, בין היתר, צבעים DNA חיוניים כגון Hoechst 33342. התאים מסודרים עם השיטה מזוהית בתור "אוכלוסייה בצד" (SP). כאשר תאי SP מהווים אחוז נמוך (<5%) של תאים הוריים, שלב הולך וגדל הוא הכרחי על מנת להגדיל את מספרם לפני מיון התא השני. השלב הבא מאפשר את הבחירה של תאים שיש להם שני מאפיינים של תאי גזע HNSCC אחרים כלומר רמת ביטוי גבוהה של הסמן על פני קרום התא CD44 (CD44 גבוה) ואת יתר ביטוי של דהידרוגנז אלדהיד (ALDH גבוהה). מאז שימוש סמן יחיד יש מגבלות רבות ואת חסרונות עבור הבידוד של CSCS, השילוב של SP, CD44 וסמני ALDH יספקו כלי שימושי כדי לבודד CSCS עבור מבחני אנליטית נוספים ופונקציונליים הדורשים תאי קיימא. המאפיינים דמוי גזע של CSCS שקיבל תוקף ולבסוף במבחנה כתוצאה מהיווצרותם של tumorispheres ואת הבעת-קטנין β.
Introduction
ראש תא צוואר קשקש קרצינומה (HNSCC) היא סרטן נפוץ ברחבי העולם ולמרות התקדמות טיפולים שוטפים, חולים עם מחלה מתקדמת בעלות פרוגנוזה נמוכה. שיעור ההישרדות של 5 שנים הכוללת של המטופל הוא סביב 30% למרות השילוב של גישות טיפוליות כוללים ניתוחים, כימותרפיה והקרנות-וממוקדים-טיפולים. מחקרים שנעשה לאחרונה מייחסים הישנות מקומיים גרורות מרוחקות להישרדות של תאי גזע דמוי סרטן (CSCS) בעקבות טיפולים נגד סרטן 1. יש עדויות מצטברות התומכים בקיומה של תאים מציגי המאפיינים תאי גזע (מעמד מובחן, יכולות התחדשות עצמית והבחנה, ופעילות טלומרז) בגידולים מוצקים שונים כולל סרטן השד, המוח, הערמונית, הריאות, המעי הגס, לבלב, כבד ועור 2- 10. עם זאת, המקור של CSCS עדיין לא ברור 11,12. הם עשויים לנבוע שינוי ממאיר של תאי גזע נורמליים 3,13 או dedifferentiation של תאים סרטניים כי לרכוש תכונות CSCS דמוי 14,15. לכן, הבנת מסלולים ייחודיים הנוגעים CSCS תספק תובנה אבחון מוקדם וטיפול של HNSCC עמיד.
הוצע כי CSCS גם בעלי פנוטיפים עמיד כי להתחמק כימותרפיה והקרנות סטנדרטיות, וכתוצאה מכך ישנות גידול לעומת חלק הארי של תאים סרטניים 16-19 והם מקומיים לתוך היפוקסי נישות 20. גורמים רבים הוצעו על מנת להסביר התנגדויות אלה של CSCS, כגון נטיית קפאון, תיקון DNA משופר, מנגנוני בקרת מחזור התא למעלה מוסדר, ו רדיקלים חופשיים הדחה 21. יתר על כן, מספר מסלולים מולקולריים בשעור ניתן להפעיל באופן ספציפי CSCS 17. על מנת לשפר את הידע של CSCS עבור טיפולים במיקוד, אנו זקוקים שיטות אמינות לזיהוי והבידוד של CSCS, בשל ההטרוגניות של סמני תא הקשורות גזעסוגים שונים של סרטן 22.
בשנת HNSCC, גזע דמוי תאי ייזום גידולים בודדו מגידולים מטופלים העיקרי ידי מיון תאי מבטאי סמני CSC שונים (כגון ביטוי מובילים בזרימת תרופת 23, גבוה CD44, CD133 הנמוך CD24 גבוה, c-Met + פנוטיפ 10,24, 25, או ALDH גבוהה פעילות 26) או לטפח גידול מטופל עיקרי ליצירת squamospheres בעלי תכונות CSC. אף על פי כן, מספר squamospheres פוחתת באופן דרמטי לאחר שני קטעים, ובכך לתת גודל מדגם קטן עבור אפיון נוסף שלומד 27. לכן, מבחני חוץ גופייה החל שורות תאים ומבוססות הוא פתרון קל יותר לתכנן את ניסויים על מנת לשפר את הידע של CSCS.
מטרת מאמר זה היא להציע שיטה לבודד CSCS שורות תאים HNSCC באמצעות ניתוח תזרים cytometric multiparametricnd מיון התא. הביטוי של CD44 בקורלציה עם מספר מאפיינים CSCS כולל פעילות ALDH, אוכלוסייה סייד (SP) פנוטיפ, יכולת גיבוש אליפטית ו tumorigenicity משמשים לבודד ולאפיין תת-אוכלוסייה זו של CSCS. CD44, גליקופרוטאין על פני קרום התא, הוא מעורב הידבקות נדידת תאים. CD44 מבוטא בכמות גבוהה בגידולים רבים מוצק 28 CSCS, כולל במודלים סרטן הראש והצוואר 29-31. יתר על כן, תאים גבוהים CD44 יכולים ליצור in vivo גידול הטרוגנית בעוד תאים נמוכים CD44 יכול לא 10. את assay SP מבוסס על פוטנציאל ההפרש של תאים בזרימה לצבוע Hoechst 22 דרך קלטת מחייב ATP (ABC) המשפחה של חלבוני טרנספורטר overexpressed בתוך הממברנה CSC. assay זה כולל את השימוש של מעכבי טרנספורטר ABC כגון verapamil בדגימות שליטה. dehydrogenase אלדהיד (ALDH) הוא אנזים תאי כי הוא מעורב המרת רטינול RETחומצת inoic במהלך התמיינות תאי גזע מוקדם 25,26. תאים להפגין התנהגות תאי גזע דמוי ניכרת פעילות ALDH הגבוה HNSCC 26 ומספר מעט מאוד של תאים גבוהים ALDH מסוגלים ליצור גידולי in vivo 26,32.
השילוב של סמנים ומאפיינים אלה שימש בהצלחה על ידי אל e t ברטרנד. ללמוד את ההתנגדות במבחנה ובחי של CSCS אלה פוטון יון פחמן קרינה 19. התוצאות שלהם הראו בבירור כי השילוב של סמנים ומאפייני תאים שונים הם בררני יותר ללימודים שימושיים על אוכלוסיות HNSCC CSCS מאשר גישות חד סמן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
נהלי כל החיה בוצעו בהתאם להנחיות מקומיות על טיפול בבעלי חיים. כל הפרטים של מחקר זה אושרו על ידי CECCAPP, ועדה האתיקה צרפתית.
בחירת 1. של אוכלוסייה סייד (SP) על ידי Assay בזרימת דיי Hoechst
- מכתים 50 מיליון תאים עם 33,342 לצבוע Hoechst.
- כן שני 15 מיליליטר צינורות סטרילית עם תחתית חרוטים: צינור אחד שכותרתו "Hoechst" ואחד שכותרתו "Hoechst ו Verapamil". הכן 10 מ"ל של 5 פתרון hydrochloride מ"מ Verapamil במים סטריליים. הכן את מדיום התרבות (CM) עבור תאי גזע.
- כדי להכין CM עבור CSC (CM-CSC), לשלב את הבאים: F12 (1: 3, v: v), 5% של העובר עגל בסרום (FCS), 0.04 מ"ג / ליטר של הידרוקורטיזון (DMEM) בינוני הנשר שונה של Dulbecco , 100 U / ml פניצילין, 0.1 גר '/ ל של סטרפטומיצין, ו -20 מיקרוגרם / ליטר של גורם הגדילה באפידרמיס (EGFR).
- מתחת למכסה מנוע זרימה למינרית, trypsinize תאים. סר מדיה, לשטוף עם יםterile בופר פוספט (PBS) ולהוסיף 1 מ"ל של טריפסין EDTA (0.5 גר '/ ל) עבור בקבוק 75 סמ"ר. דגירה 3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. עצור את התגובה על ידי הוספת בינוני תרבות המשמש הקו הסלולרי ההורי. ספירת התאים באמצעות דלפק תא.
- כדי להכין CM עבור שורת תאים ההורית (CM-P), להשלים DMEM עם 10% FCS, 0.4 מ"ג / ליטר של הידרוקורטיזון, 100 U / ml של פניצילין 0.1 גר '/ ל של סטרפטומיצין).
- לדלל את ההשעיה תא שהושגו בשלב 1.1.2 להשיג 10 מ"ל 7 תאים / ב-P CM. פיצול ההשעיה תא 2 צינורות מוכן: לשים 100 μl (10 6 תאים) בצינור "Hoechst ו Verapamil" ו -4 מ"ל (4 x 10 7 תאים) בצינור "Hoechst".
- במדגם "Hoechst ו Verapamil", להוסיף 10 μl של 5 פתרון hydrochloride מ"מ Verapamil (ריכוז סופי: 0.5 מ"מ) ומערבבים בעדינות. הוסף 5 μl של 1 גר '/ פתרון L Hoechst (ריכוז סופי: 0.1 גר' / ל). במדגם & #34; Hoechst ", להוסיף 5 μl של 1 גר '/ פתרון L Hoechst לכל 10 6 תאים (200 סך μl) מכאן ואילך, לשמור דגימות מפני חשיפה לאור ישיר באמצעות רדיד אלומיניום..
- דגירה כל הצינורות באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה ו -30 דקות. מערבבים בעדינות כל 15 דקות כדי למנוע מתאי שהתיישב.
- צינורות צנטריפוגה ב 250 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C. הסר supernatant ו resuspend כל גלולה עם 2 מ"ל של 1x PBS.
- צינורות צנטריפוגה ב 250 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C. הסר supernatant. Resuspend "Hoechst ו Verapamil" גלולה ב 500 μl של 5 מ"ג / L יודיד propidium (PI) מדולל PBS חיץ "Hoechst" גלולה ב 4 מ"ל של 5 מ"ג / L PI מדולל במאגר PBS.
- העבר פתרונות מדגם דרך מסננת תא 70 מיקרומטר כדי להסיר אגרגטים ולאסוף תאים בודדים צינורות עבור ספיגת מדגם על cytometer את הזרימה. שמור על דגימות קרח ולהגן מפני חשיפה לאור ישירה באמצעות רדיד אלומיניום.
- כן שני 15 מיליליטר צינורות סטרילית עם תחתית חרוטים: צינור אחד שכותרתו "Hoechst" ואחד שכותרתו "Hoechst ו Verapamil". הכן 10 מ"ל של 5 פתרון hydrochloride מ"מ Verapamil במים סטריליים. הכן את מדיום התרבות (CM) עבור תאי גזע.
- אניsolation של האוכלוסייה צד לא כולל לצבוע Hoechst ידי מיון התא.
- בצעו הפרדה תא שלילי Hoechst על זרימה cytometry סדרן עם הפרמטרים הבאים: לייזר UV (355 ננומטר), 2 גלאי בדרך לייזר UV עם Hoechst כחול (450/50 BP) ו Hoechst אדום (610/20 BP) מסננים, 2 אספנים.
- ראשית, לנתח מדגם "Hoechst" המשרת כביקורת חיובית מכתים וזרימה הגדרת cytometer.
- שימוש בתוכנת cytometer, על החלון "הגיליון העולמי", לחץ על "דוט מגרש" (חמישי דף תמונה מימין) ליצור תרשים בגיליון העבודה הגלובלי. ביום לתאם, עם קליק ימני, ובחר FSC-A (פיזור קדימה) ועל abscissa, SSC-A (פיזור צד) (איור 1 א). באותו אופן, ליצור SSC-W לעומת עלילת נקודת SCC-H. על מגרש נקודה שני זה, כדי ליצור אזור P1, לחץ על "מצולע שער" (הי"ד דף תמונה מימין) (איור 1B) 33.
הערה: אזור P1 יהיהלהקיף תאים בודדים ולהפלות כפילויות. - אופציונלי: אל תכלול PI תאים חיוביים על ידי יצירת-A FSC לעומת PI מגודרת על P1. על מגרש נקודה זו, בחר את האוכלוסייה השלילית PI (P2) להוציא תאים מתים חיוביים PI.
- שימוש בתוכנת cytometer, על החלון "גליון העולמי", לחץ על "דוט מזימה" ליצור תרשים בגליון העבודה הגלובלי. ביום לתאם, עם קליק ימני, ובחר Hoechst-כחול ועל abscissa, Hoechst-אדום. עם קליק ימני על האוכלוסייה, בחר "אוכלוסיית צג" ו P1. על מגרש נקודה זו, ליצור אזור (P2) כדי לבחור את האוכלוסייה שלילי בצד לצבוע Hoechst (SP) תאים שמופיעה כזרוע בצד השמאלי של האוכלוסייה העיקרית של תאים (תרשים 1C).
- לנתח את המדגם "Hoechst" לאסוף 10,000 אירועים. כדי להבטיח כי P2 השער, המייצג את אוכלוסיית SP, הוא ממוצבת היטב, לנתח את המדגם "Hoechst ו Verapamil" (10,000 אירועים)כדי לבחון את היעלמותו של אוכלוסיית SP (1D איור).
- אוסף את התאים שליליים לצבוע SP Hoechst בתוך שפופרת 15 מיליליטר המכילה 1 מיליליטר של CM-CSC ערוך 1.1.1.1.
- בסוף של מיון התא, צנטריפוגה ההשעיה תא ב 250 XG במשך 5 דקות, להסיר את supernatant ו resuspend גלולה עם 1 מ"ל של CM-CSC. ספירת תאים ממוינים באמצעות מונה תא ולהעביר מספר המתאים של תאי בקבוק תרבות (ראה טבלה 1). להוסיף CM-CSC ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס ואווירה 5% CO 2.
- לשמור על תאים בתרבית בתנאים הזהים לכל היותר 2 קטעים עד שיהיו מינימום של 5 x 10 7 תאים (ראה שלב 3, "שיטת Cell תרבות").
- בצעו הפרדה תא שלילי Hoechst על זרימה cytometry סדרן עם הפרמטרים הבאים: לייזר UV (355 ננומטר), 2 גלאי בדרך לייזר UV עם Hoechst כחול (450/50 BP) ו Hoechst אדום (610/20 BP) מסננים, 2 אספנים.
בחירת 2. של CD44 הגבוה / ALDH גבוה תת-האוכלוסייה הממוינת אוכלוסין Side
- מכתים 50 מיליון תאים SP עם ערכת זיהוי ALDH ו- Cנוגדן D44.
- הכן שבע 15 מ"ל צינורות סטרילית שכותרתו כדלקמן: "בלא כתם" (צינור), "CD44-APC" (ב Tube), "IgG1-APC" (ג Tube), "ALDH" (Tube ד), "ALDH ואת DEAB "(Tube ה)," ALDH ו CD44-APC "(Tube ו)," ALDH, DEAB ו CD44-APC "(ז Tube). שמור את כל צינורות ריאגנטים ב 4 מעלות צלזיוס במהלך מכתים.
- הכן חיץ עם 4.5 מ"ל של חיץ 1 (הכלול בערכה) ו -45 μl של CD44-APC (Allophycocyanin) נוגדנים (דילול 1: 100). הכן חיץ B עם 100 μl של חיץ 1 ו 1 μl של נוגדן IgG1-APC (דילול 1: 100). הכן חיץ C עם 4 מ"ל של חיץ 1 ו -20 μl של מגיב של הערכה.
- הכן ההשעיה תא של תאים ממוינים בעבר (שלב 1.2.5) בשעה 10 7 תאים / מ"ל. הוספת 100 μL (10 6 תאים) של ההשעיה התא צינורות a, b ו- c, ו -4 מ"ל (4 x 10 7 תאים) כדי צינור f. לרגע לא לשים תאי צינורות D, E ו- g.
- צנטריפוגה צינורות המכילים את התאים ב 250 XG במשך 5 דקות. הסר את supernatant ו resuspend את כדורי ב צינורות a, b ו- c ב 100 μl של חיץ 1. הוסף 5 μl של diethylaminobenzaldehyde (DEAB), מעכב ALDH צינורות דואר ו- g.
- תאים Resuspend בצינור f באות C מגיב 4 מ"ל ומיד להעביר 100 μl לתוך צינורות D, E ו- g. דגירה כל הצינורות באמבט מים ב 37 ° C למשך 30 דקות ולהגן מפני חשיפה לאור ישירה באמצעות רדיד אלומיניום. מערבבים את ההשעיה תא בעדינות על ידי vortexing לאחר 15 דקות כדי למנוע מתאי שיקוע.
- מרגע זה, לשמור את הצינורות על קרח מוגן מפני חשיפה לאור ישירה באמצעות רדיד אלומיניום. צנטריפוגה כל צינורות ב 250 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant.
- f צינור Resuspend ב 4 מ"ל וצינורות b ו- g עם 100 μl של ג הצינור חיץ א גלולה עם 100 μl של חיץ .ב הצינורות אחרים, להוסיף 100 μl של חיץ 1. דגירה 10 דקות ב 4 °; C.
- צנטריפוגה כל צינורות ב 250 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant. יש לשטוף מיד עם 1 מ"ל של חיץ 1 (4 מ"ל עבור F צינור) ו צנטריפוגות שוב ב 250 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.. הסר את supernatant. Re- להשעות גלולה צינור f ב 4 מ"ל וכל צינורות אחרים ב 1 מ"ל של חיץ 1.
- מעבירים את פתרונות מדגם דרך מסננות תא 70 מיקרומטר כדי להסיר אגרגטים ולאסוף תאים בודדים צינורות מתאים ספיגת מדגם על cytometer זרימה.
- בידוד של אוכלוסיית תא גבוה גבוהה / ALDH CD44 על ידי קרינת מיון מופעל תא.
- בצע CD44 גבוה / ALDH גבוהה מיון התא על זרימה cytometry סדרן עם הפרמטרים הבאים: לייזר כחול (488 ננומטר) לייזר אדום (633 ננומטר), 1 גלאי בדרך לייזר כחול עם מסנן FITC (530/30), 1 גלאי בדרך לייזר אדום עם מסנן APC (660/20) ו -2 אספנים.
- שימוש בתוכנת cytometer, לחץ על "דוט אש"ףt "(בתמונה הימנית העליונה החמישית) ליצור-A FSC מול SSC-העלילה נקודה כמפורט בסעיף 1.2.1.2, לבדוק מורפולוגיה התא ובחר אוכלוסייה מורכבת של תאים בודדים עם SSC-W לעומת SSC-H עלילת נקודה.
- שימוש בתוכנת cytometer, על החלון "גליון העולמי", לחץ על "דוט מזימה" ליצור תרשים בגליון העבודה הגלובלי. ביום לתאם, עם קליק ימני, ובחר APC-A ועל abscissa, FITC-A כדי לבחור את האוכלוסייה צבעונית כפולה. צור שער באמצעות צינורות D ו- E כדי לבחור תאים גבוהים ALDH (איור 2 א). הערה: תאים חיוביים להיעלם בצינור דואר שטופל DEAB (איור 2 ב).
- באותו התרשים, ליצור שער שני באמצעות צינורות B ו- C כדי לבחור תאים גבוהים CD44 (איור 2 ג ו 2D). תאים חיוביים להיעלם בתוך השפופרת המכילה IgG1-APC. לנתח צינורות F ו- G וליצור שער שלישי הכולל CD44 גבוה / ALDH <sup> תאים גבוהים (איור 2E ו 2F).
הערה: אם תאים חיוביים נמצאים בצינור המכיל IgG1-APC (איור 2 ד), האינטראקציה בין התאים ואת נוגדן APC המוכתם אינה ספציפית.
- באותו התרשים, ליצור שער שני באמצעות צינורות B ו- C כדי לבחור תאים גבוהים CD44 (איור 2 ג ו 2D). תאים חיוביים להיעלם בתוך השפופרת המכילה IgG1-APC. לנתח צינורות F ו- G וליצור שער שלישי הכולל CD44 גבוה / ALDH <sup> תאים גבוהים (איור 2E ו 2F).
- אסוף CD44 גבוה / ALDH תאים גבוה לתוך צינור 15 מ"ל המכילה 1 מ"ל של CM-CSC. אסוף גם CD44 נמוך / ALDH נמוך לתוך צינור 15 מ"ל המכילה 1 מ"ל של CM 19. הערה: כן CM-CSC כמתואר בשלב 1.1.1.1.
- צנטריפוגה ההשעיה התא ב 250 XG במשך 5 דקות, להסיר את supernatant ו resuspend גלולה עם 1 מ"ל של CM-CSC. ספירת תאים ממוינים.
3. תא תרבות שיטה
- לאחר המיון הכפול של התאים כפי שתואר לעיל, הצלחת התאים הממוינים לתוך בקבוק מתאים תרבות (טבלה 1) עם CM-CSC ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. לאחר 18-24 שעות,לבדוק אם התאים יש דבק ולשנות את המדיום לתרבות. שינוי התרבות הבינונית כל 3 ימים עד מושבות ההרחבה הם גדולות יותר ומחוברות 50%.
- השתמש הנפח המתאים של טריפסין 0.5 גר '/ ל - EDTA (טבלת 1) כדי trypsinize תאים מבקבוק התרבות. דגירת תאים 3 עד 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. להוסיף נפח מתאים של CM-CSC (טבלה 1) כדי להפסיק את הפעולה של טריפסין.
- ספירת התאים המתקבלים צלחת 4 x 10 5 תאים בבקבוק תרבות 175 סמ"ר עם CM-CSC. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. בריכוז זה, תאים עם זמן הכפלה של 24 שעות יהיו ומחוברות 70% ב -7 ימים.
- השתמש CSCS עבור במבחנה או בניסויים vivo לפני שהם עברו 3 קטעים.
4. אישור פוטנציאל הגידול ומאפייני CSC
- היווצרות גידולי Sphere כדי לאשר את פוטנציאל הגידול של גבוה / ALDH CD44תאים גבוהים.
- Trypsinize תאים כמתואר 3.2. הוסף 1 x 10 6 תאים לצינור צנטריפוגות 15 מ"ל ב 250 XG במשך 5 דקות. הסר את supernatant מחדש להשעות את גלולה DMEM: F12 (3: 1) בינוני FCS חינם, 20 ng / ml של rhEGF, 4 מ"ג / ליטר של הפרין 1x B27. דגירת תאי בקבוק תרבות צלחות למעגן נמוך 6 היטב ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
הערה: השתמש DMEM: F12 (3: 1) בינוני המכיל 5% של FCS, 20 ng / ml של rhEGF, 4 מ"ג / ליטר של הפרין 1x B27 אם התא לא גדלים בלי FCS. - לצפות את היווצרות כדור גידול עם מיקרוסקופ אופטי -4 עד 10 ימים לאחר הזריעה (איור 3 א).
הערה: קוטר כדור גידול צריך להיות יותר מ -35 מיקרומטר. CD44 גבוהים / תאים גבוהים ALDH נראו במערך בתחום גידול משופר מהר ויותר במונחים של מספר וגודל לעומת CD44 נמוך / ALDH נמוכה.
- Trypsinize תאים כמתואר 3.2. הוסף 1 x 10 6 תאים לצינור צנטריפוגות 15 מ"ל ב 250 XG במשך 5 דקות. הסר את supernatant מחדש להשעות את גלולה DMEM: F12 (3: 1) בינוני FCS חינם, 20 ng / ml של rhEGF, 4 מ"ג / ליטר של הפרין 1x B27. דגירת תאי בקבוק תרבות צלחות למעגן נמוך 6 היטב ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- הערכת in vivo tumorigenicity לאחרהזרקה תת עורית של תאים גבוהים גבוהים / ALDH CD44 עכברי NOD-SCID.
- לאחר מיון, מחדש להשעות התאים PBS ב בשלושה ריכוזים שונים (10 מ"ל 4 תאים /, 10 מ"ל 5 תאים /, ו 10 6 תאים / מ"ל). להזריק תת עורי 100 μl של 10 מ"ל 4 תאים / (10 3 תאים) באזור האגף הימני של 6 עכברים. לעשות את אותו הדבר עבור 10 מ"ל 5 תאים / (10 4 תאים), ו -10 מ"ל 6 תאים / (10 5 תאים).
הערה: דילול תחתון מ -10 3 תאים יכולים להיבדק. - להזריק את הריכוז הזהה של CD44 נמוכים / תאים נמוכים ALDH באזור בכנף השמאל. צג מוזרק עכברים עד 10 שבועות כדי לראות התקדמות הגידול 19.
- לאחר מיון, מחדש להשעות התאים PBS ב בשלושה ריכוזים שונים (10 מ"ל 4 תאים /, 10 מ"ל 5 תאים /, ו 10 6 תאים / מ"ל). להזריק תת עורי 100 μl של 10 מ"ל 4 תאים / (10 3 תאים) באזור האגף הימני של 6 עכברים. לעשות את אותו הדבר עבור 10 מ"ל 5 תאים / (10 4 תאים), ו -10 מ"ל 6 תאים / (10 5 תאים).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בידודו של CSCS שורות תאי HNSCC היה כרוך בשני מיון רצוף בגלל האחוז הנמוך מאוד של CSCS בקו התא ההורי. המיון הראשון התבסס על היכולת של CSCS להוציא לצבוע Hoechst בשל מובילים בזרימת תרופה. זה הביא רכישת 1-5% מכלל האוכלוסייה תא הכולל מסודרים (איור 1). במהלך מיון תא Hoechst לצבוע שלילי, לבדוק את גודל פרור של תאים ממוינים מלהסתכל-A FSC מול SSC-עלילת נקודה (איור 1 א). לאחר מכן, להפלות כפילויות ושברי תאים באמצעות SSC-W לעומת העלילה נקודה SSC-H ובחירת P1 האוכלוסייה (איור 1B). על אוכלוסיית P1 זו, צור-A האדום Hoechst לעומת Hoechst כחול-עלילת נקודה. עם צינור שכותרתו "Hoechst", SP מופיע כזרוע לוואי משמאל מן האוכלוסייה התאים העיקריים (תרשים 1C). אוכלוסייה זו חייבת להיעלם כשהם arדואר שטופל Verapamil (איור 1D), מעכב של מובילי ABC. מכתים PI מאפשר ההרחקה של תאים מתים PI-חיובי כי אוכלוסייה זו נמצאת תחת מידה על Hoechst האדום-סולם (איור 1 ג ו 1D, אליפסות כחולות).
מיון התא השני התבסס על רמת הביטוי הגבוה של הקולטן CD44 והגבוה ALDH פעילות האנזים אשר אפשרה רכישת 0.5-2% מתאי SP המסודרים בעבר (איור 2). לפני המיון, פקדים שונים שמשו. הראשונים הם "ALDH" ואת הצינורות "ALDH + DEAB" הדרוש על מנת למקם את השער הראשון על תאים גבוהים FITC (איורי 2 א ו -2): תאים גבוהים ALDH היו מגודרים על-A FITC לעומת APC-נקודה העלילה באמצעות צינור (איור 2 א) "ALDH". העמדה הטובה של השער נבדקה באמצעות "תלדH + DEAB "צינור:.. כמו DEAB מעכב ALDH, תאים חיוביים חייבים להיעלם מן השער (התרשים 2B) אם הם לא, לשנות את תנאי התגובה (על ידי הגדלת הכמות של DEAB למשל) הפקד השני הוא" CD44-APC "ואת" צינורות IgG1-APC "אשר אפשרו למקם את השער השני על תאים גבוהים APC (2C דמויות 2D) באמצעות התאים מוכתם נוגדן CD44-APC (איור 2 ג). אוכלוסייה זו חייבת להיעלם עם צינור מלא שהכיל תאי IgG1-APC (איור 2 ד). אם לא, את הקשר עם הנוגדן אינו ספציפי ו BSA 0.5% יש להוסיף למאגר 1 מתוך הערכת זיהוי ALDH במהלך תגובת הנוגדן. לבסוף, השלישי שליטה נוגעת צינור "ALDH ו CD44-APC" ו "ALDH, DEAB ו CD44-APC" צינורות (2E הדמוי, 2F, 2G ו 2H). STA הכפולצינור ining ALDH / CD44 משמש עמדת השער האחרון על התאים החיוביים הכפולים (איור 2E) ואת הצינור אותו שטופל DEAB הוא פקד כדי לוודא כי תאים גבוהים ALDH להיעלם (איור 2F).
פרוטוקול זה משמש כדי למיין CSCS מן SQ20B ואת שורות תאי פאדו. כאשר המיון נעשה לראשונה על שורת תאים חדשה, על מנת להבטיח כי תאים ממוינים יש הגבעולי מאפייני תאים, יש צורך לאשר פוטנציאל הגידול שלהם. אחד נכס תאי הגזע דמוי הוא יכולתו ליצור tumorspheres במבחנת בתווך חופשי FSC. תחת תנאי זה, רק תאי גזע דמוי סרטן יכולים לשרוד ולהתרבות (איור 3 א). יתר על כן, ניסויי qPCR מראים ביטוי גבוה של β-קטנין (סמן של מאפיין הגבעולי) ב CD44 גבוהים / תאים גבוהים ALDH (איור 3 ב), כמו גם BMI-1 ו Notch 19 </ Sup>. לבסוף, CD44 הגבוה / ALDH תאים גבוהים הם גם מסוגלים ליצור גידולים כאשר הוא מוזרק בכמויות נמוכות לעומת CD44 נמוכים / תאים נמוכים ALDH 19.
איור 1: בידוד של אוכלוסייה בצד למעט לצבוע Hoechst (א) FSC-A לעומת SSC-עלילת נקודה.. (ב) SSC-W לעומת עלילת נקודת SSC-H. (C, D) Hoechst האדום-A לעומת Hoechst כחול-עלילת נקודה באמצעות הצינור "Hoechst" (C) או עם "Hoechst ו Verapamil" הצינור (ד '). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: אז rting של תאים גבוהים גבוהים / ALDH CD44 מתאי שלילי לצבוע Hoechst. FITC-A לעומת APC-עלילת נקודה באמצעות הצינור "ALDH" (א), את "ALDH + DEAB" צינור (ב), "APC-CD44" צינור (C), הצינור "IgG1-APC" (ד), "ALDH ו CD44-APC" צינור (E ו- G) או הצינור "ALDH, DEAB ו CD44-APC" (F ו- H). דמויות A, B, C, D, E ו- F התקבלו באמצעות שורת תאים SQ20B. דמויות G ו- H המתקבל באמצעות שורת תאים פאדו. ירוק מציין נמוך CD44 / תאים נמוכים ALDH (Q3); כחול כהה מציין נמוך CD44 / תאים גבוהים ALDH (Q1); סגול עולה גבוה CD44 / תאים נמוכים ALDH (Q4); תכלת מציינת גבוהה CD44 / תאים גבוהים ALDH (Q2)."Target =" _upload / 53,958 / 53958fig2large.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. אישור של פוטנציאל גידול של CD44 גבוהים / תאים גבוהים ALDH הממוין CD44 גבוהים / תאים גבוהים ALDH הצליח ליצור tumorspheres במבחנה (א) בתוך תקשורת ירודה FCS. סרגל קנה מידה, 25 מיקרומטר. יתר על כן, CD44 גבוהה / גבוהה overexpress ALDH β-קטנין, סמן של tumorigenicity (B). כימות זה בוצע על ידי qPCR וברי שגיאה מייצג SD. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| מספר התאיםמְמוּיָן | סוג בקבוק תרבות | נפח טריפסין (מ"ל) | בינוני נפח תרבות (מ"ל) |
| 10,000-200,000 | גם 1 של צלחת 6-היטב או בצלחת פטרי 3.5 ס"מ | 0.5 | 2 |
| 200,000-1,000,000 | בקבוק 1 T25 תרבות | 1 | 4 |
| > 1,000,000 | בקבוק 1 T75 תרבות | 2 | 10 |
טבלה 1: סוג הבקבוק תרבות להשתמש לפי מספר תאים ממוינים פרטים של גודל בקבוק תרבות עבור המספר המשוער של תאים ממוינים מקבלים.. היקף טריפסין נפח בינוני נדרש עבור סוג בקבוק תרבות מסופקים אף הם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה עבור הבידוד המוצלח של CSCS משורת תאים ספציפית כי הוא ישים שורות תאי HNSCC אחרות. CSCS הראש והצוואר מבודד אז הם מתאימים לאפיון מולקולרי נוסף במבחנה ואימות פונקציונלית ידי השתלה בעכברי immunodeficient 19. עם זאת, כמה שינויים יכול להיבדק בהתאם האוכלוסייה בצד או באחוזים גבוהים גבוה / ALDH CD44 נוכח שורת תאים ההורית. לדוגמא, אם אחוז התאים באוכלוסיית הצד נמוך מדי בקו תא מסוים, מיון CD44 הגבוה / ALDH הגבוה יכול להתבצע ישירות. הסמנים השתמשו במחקר זה עשויים להיות מוחלפים על ידי סמנים אחרים מתאימים הקו הסלולרי למדו כגון CD133 גבוה 34 או CD10 גבוה 35.
פרוטוקול זה מבוסס על שני sortings התא. שלושה צבע מיון עם SP + CD44 + ALDH לא possiblדואר עם שורות התאים הנבדקות. ראשית, שורות תאים ההוריות נבדקות כאן נוכחי פחות מ -5% של SP ופחות מ -10% CD44 גבוה / ALDH תאים גבוהים SP. לכן, SP / CD44 גבוה / ALDH גבוהה מהווה פחות מ -0.5% של הקו הסלולרי ההורי. לפיכך, מיון SP ראשון הוא הכרחי על מנת להעשיר את אוכלוסיית CD44 גבוה ו / או ALDH תאים גבוהים. שנית, כדי למיין 1% של הקו הסלולרי ההורים, זה לוקח 5 שעות כדי להשיג כ 300,000 תאים. לכן, אם מיון תא צבע 3 נעשה, כמות תאים שנאספו תהיה נמוכה מאוד. יתר על כן, כבר המיון אינו מומלץ מכיוון שהוא עלול להשפיע על כדאיות התא.
בשל הסלקטיביות של פרוטוקול הבידוד הזה, המגבלה העיקרית היא המספר הקטן של CSCS שהושגו. זה יכול להיות בעייתי לבצע ניסויים נוספים, שכן הוא לא מומלץ להשתמש בהם לאחר 3 קטעים בגלל איבוד מהיר של CD44 ו- Aסמני LDH. יתר על כן, לפני כל ניסוי חדש, אחוז CD44 הגבוה / ALDH תאים גבוהים עדיין נוכח השעית התא צריך להיבדק על מנת לבדוק את מספר CSCS אשר הבדיל.
זה הכרחי כדי להכין פתרון hydrochloride Verapamil ובינוני תרבות המכיל EGF רק לפני השימוש כמו המולקולות האלה הן מאוד לא יציבות. פתרון המניות של EGF ב 20 מ"ג / L הוא יציב במשך שלושה חודשים ב -20 ° C. וריאציות של פרוטוקול Hoechst להתקיים, אך ריכוז לצבוע הסופי נפוץ הוא 5 מיקרוגרם / מ"ל. יתר על כן, במהלך המיון הראשון, יצירות תרבות תקשורת שונות צריכות להיבדק על פי שורת התאים בשימוש. ברגע שתנאי המיון הן תוקפים, יש צורך לבדוק את המאפיינים של אוכלוסיית תאים הממוינת באמצעות השיטות השונות (סעיף 4).
סמנים פני התא, פעילות ALDH ויכולת בזרימת צבעים חיוניים כבר שימשו individually בספרות לבודד CSCS מ HNSCC. עם זאת, הפרוטוקול המתואר כאן יש את היתרון הייחודי של באמצעות שילובים של סמנים שונים על מנת להשיג סגוליות גבוהות בבידוד CSCS שורות תאי HNSCC. יתר על כן, CD44 מיון יכול להתממש עם נוגדן אנטי CD44 מצומדות עם מיקרו-חרוזים מגנטיים מסודרים עם טור המגנטי 36, אך שיטה זו היא רק החלים על שטח פני התא סמנים ולא יכול לשמש עבור מיון ALDH, מניעת מיון כפול . שיטה נוספת להשתמש כדי להשיג CSCS היא התרבות tumorsphere מן גידולים ראשוניים 37 או xenografts 38. עם זאת, רכישת גידולים או xenografts ראשוניים אלה קשורות אילוצים מוסריים.
מאז שיטה זו מבודד CSCS HNSCC קיימא, הם יכולים לשמש (לאחר בדיקת tumorigenicity שלהם) במספר ניסויים למדוד את הפונקציה הפיזיולוגית של תאים אלה. זה ולכן מאפשר הערכה של ההתנהגותשל CSCS הבא גישות טיפוליות שונות (רדיותרפיה, כימותרפיה). זה גם מאפשר הלימוד של פרמטרים ביולוגיים שונים, כגון הגירה / פלישה, תיקון DNA, איתות תא, וכו '. לפיכך, קבלת CSCS מתוך שורות תאים שונות היא בחירה אטרקטיבית על חקירת תכונות CSCS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1x) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Heparin | StemcellTM Technologies | 7980 | |
| B-27 Supplement (50x), minus vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V-4629 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3 |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| ALDEFLUOR Kit | Stem Cell | 1700 | |
| CD44-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-095-177 | |
| IgG1-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-093-189 | |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | - | |
| FaDu cell line | ATCC | HTB-43 | |
| Low anchorage plates | Thermo Fischer Scientific | 145383 | |
| BD FACSDiva software v8.0.1 | BD Biosciences | - |
References
- Baumann, M., Krause, M., Hill, R. Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance. Nat Rev Cancer. 8 (7), 545-554 (2008).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Res. 65 (23), 10946-10951 (2005).
- Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death Differ. 15 (3), 504-514 (2008).
- Dalerba, P., et al. Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (24), 10158-10163 (2007).
- Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90 cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
- Fang, D., et al. A tumorigenic subpopulation with stem cell properties in melanomas. Cancer Res. 65 (20), 9328-9337 (2005).
- Prince, M. E., et al. Identification of a subpopulation of cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (3), 973-978 (2007).
- Clarke, M. F., et al. Cancer stem cells -- Perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Cancer Res. 66 (19), 9339-9344 (2006).
- Soltanian, S., Matin, M. M. Cancer stem cells and cancer therapy. Tumor Biol. 32 (3), 425-440 (2011).
- Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).
- Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).
- Ratajczak, M. Z. Cancer stem cells -- Normal stem cells 'Jedi' that went over to the 'dark side.'. Folia Histochem Cytobiol. 43 (4), 175-181 (2005).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Liu, G., et al. Analysis of gene expression and chemoresistance of CD133+ cancer stem cells in glioblastoma. Mol Cancer. 5, 67 (2006).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell. Cancer Lett. 322 (2), 139-147 (2012).
- Bertrand, G., et al. Targeting Head and Neck Cancer Stem Cells to Overcome Resistance to Photon and Carbon Ion Radiation. Stem Cell Rev. 10 (1), 114-126 (2013).
- Das, B., Tsuchida, R., Malkin, D., Koren, G., Baruchel, S., Yeger, H. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem Cells. 26 (7), 1818-1830 (2008).
- Diehn, M., et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).
- Chen, Z. G. The cancer stem cell concept in progression of head and neck cancer. J Oncol. 2009, 894064 (2009).
- Zhang, P., Zhang, Y., Mao, L., Zhang, Z., Chen, W. Side population in oral squamous cell carcinoma possesses tumor stem cell phenotypes. Cancer Lett. 277 (2), 227-234 (2009).
- Zhang, Q., et al. A subpopulation of CD133(+) cancer stem-like cells characterized in human oral squamous cell carcinoma confer resistance to chemotherapy. Cancer Lett. 289 (2), 151-160 (2010).
- Sun, S., Wang, Z. Head neck squamous cell carcinoma c-Met⁺ cells display cancer stem cell properties and are responsible for cisplatin-resistance and metastasis. Int J Cancer. 129 (10), 2337-2348 (2011).
- Chen, Y. C., et al. Aldehyde dehydrogenase 1 is a putative marker for cancer stem cells in head and neck squamous cancer. Biochem Biophys Res Commun. 385 (3), 307-313 (2009).
- Lim, Y. C., et al. Cancer stem cell traits in squamospheres derived from primary head and neck squamous cell carcinomas. Oral Oncol. 47 (2), 83-91 (2011).
- Yu, Q., Stamenkovic, I. Cell surface-localized matrix metalloproteinase-9 proteolytically activates TGF-beta and promotes tumor invasion and angiogenesis. Genes Dev. 14 (2), 163-176 (2000).
- Krishnamurthy, S., et al. Endothelial cell-initiated signaling promotes the survival and self-renewal of cancer stem cells. Cancer Res. 70 (23), 9969-9978 (2010).
- Chikamatsu, K., Takahashi, G., Sakakura, K., Ferrone, S., Masuyama, K. Immunoregulatory properties of CD44+ cancer stem-like cells in squamous cell carcinoma of the head and neck. Head Neck. 33 (2), 208-215 (2011).
- Chen, Y. W., et al. Cucurbitacin I suppressed stem-like property and enhanced radiation-induced apoptosis in head and neck squamous carcinoma--derived CD44(+)ALDH1(+) cells. Mol Cancer Ther. 9 (11), 2879-2892 (2010).
- Clay, M. R., et al. Single-marker identification of head and neck squamous cell carcinoma cancer stem cells with aldehyde dehydrogenase. Head Neck. 32 (9), 1195-1201 (2010).
- Meinelt, E., et al. Technical Bulletin: Standardizing Application Setup Across Multiple Flow Cytometers Using BD FACSDiva Version 6 Software. , BD Biosciences. (2012).
- Zhou, L., Wei, X., Cheng, L., Tian, J., Jiang, J. J. CD133, one of the markers of cancer stem cells in Hep-2 cell line. Laryngoscope. 117 (3), 455-460 (2007).
- Fukusumi, T., et al. CD10 as a novel marker of therapeutic resistance and cancer stem cells in head and neck squamous cell carcinoma. Br J Cancer. 111 (3), 506-514 (2014).
- Shen, C., Xiang, M., Nie, C., Hu, H., Ma, Y., Wu, H. CD44 as a molecular marker to screen cancer stem cells in hypopharyngeal cancer. Acta Otolaryngol. 133 (11), 1219-1226 (2013).
- Kanojia, D., et al. Proteomic profiling of cancer stem cells derived from primary tumors of HER2/Neu transgenic mice. Proteomics. 12 (22), 3407-3415 (2012).
- Higgins, D. M., et al. Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts. Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).
