Glycan Node Analyse: een bottom-up benadering van Glycomics

Summary

This article presents an enhanced form of a novel bottom-up glycomics technique designed to analyze the pooled compositional profile of glycans in unfractionated biofluids through the chemical breakdown of glycans into their constituent linkage-specific monosaccharides for detection by GC-MS. Potential applications include early detection of cancer and other glycan-affective disorders.

Abstract

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and extracellular events. Many pathological conditions, notably cancer, affect gene expression, which can in turn deregulate the relative abundance and activity levels of glycoside hydrolase and glycosyltransferase enzymes. Unique aberrant whole glycans resulting from deregulated glycosyltransferase(s) are often present in trace quantities within complex biofluids, making their detection difficult and sometimes stochastic. However, with proper sample preparation, one of the oldest forms of mass spectrometry (gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS) can routinely detect the collection of branch-point and linkage-specific monosaccharides (“glycan nodes”) present in complex biofluids. Complementary to traditional top-down glycomics techniques, the approach discussed herein involves the collection and condensation of each constituent glycan node in a sample into a single independent analytical signal, which provides detailed structural and quantitative information about changes to the glycome as a whole and reveals potentially deregulated glycosyltransferases. Improvements to the permethylation and subsequent liquid/liquid extraction stages provided herein enhance reproducibility and overall yield by facilitating minimal exposure of permethylated glycans to alkaline aqueous conditions. Modifications to the acetylation stage further increase the extent of reaction and overall yield. Despite their reproducibility, the overall yields of N-acetylhexosamine (HexNAc) partially permethylated alditol acetates (PMAAs) are shown to be inherently lower than their expected theoretical value relative to hexose PMAAs. Calculating the ratio of the area under the extracted ion chromatogram (XIC) for each individual hexose PMAA (or HexNAc PMAA) to the sum of such XIC areas for all hexoses (or HexNAcs) provides a new normalization method that facilitates relative quantification of individual glycan nodes in a sample. Although presently constrained in terms of its absolute limits of detection, this method expedites the analysis of clinical biofluids and shows considerable promise as a complementary approach to traditional top-down glycomics.

Introduction

Glycolipiden, glycoproteïnen, proteoglycanen en glycosaminoglycanen vormen de vier hoofdklassen van complexe heterogene koolhydraten gezamenlijk bekend als glycanen. Zo alomtegenwoordig en een integraal onderdeel van het plasmamembraan, glycocalyx, en extracellulaire matrix en vloeistoffen, glycanen deel te nemen aan zulke uiteenlopende biochemische processen als endocytose, intracellulaire mensenhandel, celmotiliteit, signaaltransductie, moleculaire herkenning, receptor activering, celadhesie, gastheer-pathogeen interactie , intercellulaire communicatie immunosurveillance en immuunrespons initiëren. ¹ aanwezig in bijna elk gebied van het leven, enzymen bekend als glycosyltransferasen die glycan polymeren bouwen handelen combinatie met glycoside hydrolasen (ook bekend als glycosidases, wat neerkomt glycanen breken) te bouwen, verbouwen, en uiteindelijk produceren afgerond glycan polymeren ^2. Hoewel elk glycosyltransferase kan werken op verschillende glycoconjugaten, een glycosyltransferaseAldus wordt een algemeen linkage- en anomeer specifieke glycosidische binding in door de monosaccharide-eenheid met een bepaalde geactiveerde nucleotidesuiker donor (bijvoorbeeld GDP-fucose) een bepaalde categorie nucleofiele acceptoren (bijvoorbeeld een lipide, polypeptide, nucleïnezuur, of groeien oligosaccharide). Er wordt geschat dat meer dan 50% van de eiwitten (in het bijzonder membraan en secretorische eiwitten) zijn post-translationeel gemodificeerd door glycosylering ³ Rudimentary combinatorische berekeningen geven een waardering voor de grote variabiliteit, veelzijdigheid en specificiteit die aan glycoproteïnen door glycosylering.; bijvoorbeeld als een polypeptide substraat in 10 glycosylatieplaatsen en elke plaats kan een glycosidische binding met 1 van slechts 3 verschillende monosacharide-reducerende uiteinden te vormen, dan het theoretisch uiteindelijke glycoproteïne kan aannemen 3 ¹⁰ = 59.049 verschillende identiteiten. In glycoproteïnen glucosidebindingen algemeen vormen de zijketen stikstof of asparagine residuen in de sequentie Asn-X-Ser / Thr ter verkrijging van N-glycanen ² en zijketen hydroxylgroepen van serine en threonine residuen verkregen O-glycanen ⁴ (X kan elk aminozuur behalve proline is). De samenstelling van glycome een cel (dat wil zeggen, het complement van glycosylering producten) is uniek en beperkt, omdat, op enkele uitzonderingen na, glycosyltransferases vertonen strenge donor, acceptor, en koppeling specificiteit. ⁵ Belangrijke en overvloedige bloed plasma glycoproteïnen lijden afwijkende glycosylering als downstream gevolg glycosyltransferase van abnormale expressie en activiteit als gevolg van vele pathologische aandoeningen, met name kanker en infectieziekten. ^6-24

Voornamelijk als gevolg van epigenetische factoren, de glycome aanzienlijk meer divers, dynamisch en complex dan het proteoom en transcriptoom. ^25,26 Terwijl ongeveer 1% van het zoogdiergenoom codeert de vorming, modificatie enassemblage van glycanen, ²⁷ glycosylering verloopt in een niet-matrijs-gestuurde wijze-een schril contrast met polypeptide en nucleïnezuur biosynthese. De interactie tussen de relatieve hoeveelheid en activiteit van glycosylering enzymen en dergelijke omgevingsfactoren als voedingsstof en voorloper beschikbaarheid bepaalt uiteindelijk de aard, de snelheid en de omvang van glycosylering. ^5,28 embryogenese (bv, vastberadenheid en differentiatie), cellulaire activatie, en progressie door middel van de celcyclus invloed genexpressie (dwz transcriptie en vertaling) en wijzigen van de identiteit en de hoeveelheid beschikbare glycosyltransferases, waarvan de activiteit is de onmiddellijke stroomopwaarts determinant van de cel glycaan-profiel. Omdat (een deel van) de proliferatieve, lijm, en invasieve eigenschappen van kankercellen lijken op die van gewone embryogene cellen, specifieke veranderingen in glycan biosynthetische routes (bijv voorloper accumulatie, gedereguleerde expressie, aberrant modificatie structurele afknotting of nieuwe vorming) dienen als universele kanker biomarkers die verschillende stadia van tumorvorming, progressie, migratie en invasie ²⁹ geven Hoewel glycosylering is zeer complex, blijkbaar op enkele verbeteringen in glycosylering kunnen carcinogenese en metastase mogelijk.; blijkbaar, bepaalde "afwijkende" glycosyleringsproducten inderdaad kankercellen profiteren door hen in staat om het immuunsysteem erkenning ontwijken en overleven de eisen van de migratie in onherbergzame intravasculaire en metastatische omgevingen. ^28,30,31 Niet verrassend, hebben experimenten aangetoond dat de patronen van veranderde verstoren of voorkomen genexpressie en afwijkende glycan vorming kan het ontstaan ​​van tumoren Toch halt toe te roepen. ^29, de afwijkende glycanen gedetecteerd in een Biofluid monster (bijvoorbeeld, urine, speeksel en bloed plasma of serum) misschien niet direct indicatoren van kanker (of een andere ziekte), maar stroomafwaarts uitkomsten van subtiele, maar belangrijkeveranderingen in het immuunsysteem of meetbare vertakkingen van een kwaadaardige aandoening bij een onvoorspelbare orgaan. ³²

Hoewel ze bieden universele informatie over de glycome, vele moleculaire interactie gebaseerde glycomics technieken (bijvoorbeeld lectine / antilichaam-arrays en metabole / covalente etikettering) afhankelijk van de detectie van de hele glycan structuren en geen gedetailleerde structurele informatie over de verschillende glycanen niet te verstrekken. In contrast, kunnen massaspectrometrie (MS) te identificeren en kwantificeren van individuele glycan structuren en dergelijke structurele informatie de bevestigingsplaatsen om kernen polypeptide te onthullen. Gedereguleerde expressie of activiteit van één glycosyltransferase kan een cascade van schadelijke moleculaire gebeurtenissen in meerdere glycosyleringsroutes initiëren. Omdat elke glycosyltransferase kan werken op meer dan één glycoconjugaat substraat en in verschillende groeiende glycan polymeren, gedereguleerde biosynthese cascades opleveren disproportioneel verhoogde hoeveelheden van één glycan product maar verschillende heterogene klassen van afwijkende glycanen in intra- of extracellulaire vloeistoffen. ³³ Dergelijke unieke afwijkende glycanen worden soms onpraktisch als biomarkers voor kanker of andere glycan-affectieve aandoeningen, omdat, vergeleken met de grote pool van goed gereguleerde glycanen, deze afwijkende glycanen slechts een zeer klein deel dat kan vaak niet detecteerbaar blijven zelfs dergelijke zeer gevoelige technieken zoals massaspectrometrie. Bijvoorbeeld in intra- en extracellulaire lichaamsvloeistoffen, het brede eiwitconcentratie spectrum (waarvan acht ordes van grootte overspant) kan detectie van schaarse glycoproteïnen die worden gemaskeerd door de meer voorkomende soort voorkomen. ³² Bovendien bepalen glycosyltransferase activiteit blijft een aanzienlijke praktische en theoretische uitdaging, omdat veel glycosyltransferases afwezig zijn in klinische biovloeistoffen of inactief ex vivo worden. Ondanks de moeilijkheid consistenTLY opsporen en kwantificeren van ultra-kleine hoeveelheden uniek geheel glycanen, hebben beoefenaars van massaspectrometrie enorme vooruitgang geboekt in de richting van het gebruik van intact glycanen klinische markers. Recent hebben wij als aanvulling op de analyse van intacte glycanen dat gebruik GC-MS, vergemakkelijkt de detectie van alle samenstellende branch-point en koppeling-specifieke monosacchariden ( "glycan nodes ') die samen uniciteit verlenen aan elke glycan en in vele gevallen rechtstreeks dienen als moleculaire surrogaten dat de relatieve activiteit van de verwijtbare glycosyltransferase (s) te kwantificeren.

Sinds zijn eerste directe toepassing op glycaan analyse in 1958 gemeld, is gaschromatografie (GC) bewezen een krachtige techniek om per-gemethyleerd mono- en disachariden te analyseren, ³⁴ bepalen hun anomericity en absolute configuratie, en ze te scheiden voor daaropvolgende massaspectrometrische analyse. ³⁵ tussen 1984 en 2007, Ciucanu en collega'singevoerd en geraffineerd een vaste fase glycan permethylation techniek die natriumhydroxide en joodmethaan toegepast, gevolgd door vloeistof / vloeistofextractie of gepermethyleerd glycanen met water en chloroform. ^35,36 Tussen 2005 en 2008, Kang en medewerkers geïntegreerd een tijdbesparende rotatie -column aanpak in de permethylation stap. ^37,38 In 2008, het Goetz onderzoeksgroep bedacht een kwantitatieve vaste fase permethylation glycaan-profilering methode met behulp van matrix-geassisteerde laserdesorptie-ionisatie (MALDI) massaspectrometrie om te vergelijken en mogelijk onderscheid invasieve en niet -invasive borstkankercellen; ³⁹ toen, in 2009, de Goetz team gecombineerde enzymatische en technieken chemische stof in klieven O-glycanen uit intacte glycoproteïnen in een sterk basische vaste fase permethylation regeling ⁴⁰ Hoewel de Goetz procedure vergemakkelijkt gelijktijdige permethylation en chemische release. van O-glycanen, was het alleen van toepassing op pre-geïsoleerde glycoeiwitten. We pasten deze techniek in 2013 en aangepast voor de hele niet-gefractioneerde biovloeistoffen en monsters gehomogeniseerd weefsel door het opnemen van trifluorazijnzuur (TFA) hydrolyse, reductie en acetylering stappen. ³³ Deze extra stappen ook glycanen van glycolipiden en N los gebonden glycanen van glycoproteïnen en om te zetten ze in gedeeltelijk gemethyleerde alditol acetaten (PMAAs, figuur 1), waarvan de karakteristieke methylatie-en-acetylering patronen analyse door GC-MS en uniek vergemakkelijken kenmerken de samenstellende glycan knooppunten in de oorspronkelijke intacte glycan polymeer ⁴¹ (figuur 2). ³³ Uiteindelijk is dit procedure levert een samenstelling portret van de glycanen in een complex Biofluid door directe relatieve kwantificatie van glycan unieke eigenschappen zoals "kern fucosylatie", "6-sialylering", "splitsend GlcNAc" en "beta 1-6 vertakking" – elk afgeleid van een GC-MS chromatographic piek. Dit artikel geeft verdere optimalisatie van het permethylation, acetylering, isolatie, en clean-up fase, samen met verbeteringen in de wijze van relatieve kwantificatie.

Protocol

Let op: Vermijd huid en / of oogcontact met een van de reagentia gebruikt in dit experiment. Bij blootstelling, grondig spoelen het getroffen gebied met water en onmiddellijk een arts raadplegen. 1. Permethylation en Glycan Extraction Column Voorbereiding Verkrijgen zoveel microfuge spinkolom eenheid waarin het te analyseren monsters. Breek en maak de plastic reservoir buis caps. Plaats een microfuge mini filter in elk reservoir buis. Plaats de gemonteerde mi…

Representative Results

Een totale ionenstroom chromatogram (TIC) weergegeven succesvol permethylation, hydrolyse, reductie en acetylering van humaan bloedplasma monsters ten opzichte van gevallen waarin twee belangrijke stappen permethylation correct zijn uitgevoerd zijn getoond in figuur 3. Absolute Opbrengst van HexNAcs Ten opzichte van hexosen: N -ace…

Discussion

In het algemeen is de succesvolle productie van partieel gemethyleerde alditol acetaten (PMAAs) vanaf hexosen is beladen met minder problemen en is robuuster dan de succesvolle productie van N -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs. Het exacte mechanisme achter dit fenomeen speelt in elke stap van deze procedure is niet bekend, maar moet betrekking hebben op de unieke chemie van de N-acetyl groep (in plaats hydroxylgroep) die uniek is HexNAcs opzichte van hexosen. Het mechanisme achter dit verschijnsel betre…

Materials

Sodium hydroxide beads	367176	Sigma-Aldrich	20-40 mesh, reagent grade 97%
0.9 mL Spin column	69705	Pierce division of ThermoFisher Scientific	Includes  plugs and polyethylene frits
GC-MS autosampler vial (silanized)*	C4000-9	ThermoFisher Scientific	Target DP High Recovery Vial, 1.5 mL, 12 x 32 mm, Includes Teflon-lined pierceable caps
1.5 mL polypropylene test tubes	05-402-25	ThermoFisher Scientific	Snap-cap lid
2 mL polypropylene test tubes	05-408-138	ThermoFisher Scientific	Snap-cap lid
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	D8418	Sigma-Aldrich	BioReagent for molecular biology, reagent grade >99.0%
Iodomethane	I8507	Sigma-Aldrich	Contains copper as stabilizer, ReagentPlus 99%
Acetonitrile	A955-4	ThermoFisher Scientific	Optima LC/MS
Microcentrifuge	75002436: Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge	ThermoFisher Scientific	24 x 1.5/2.0 rotor with ClickSeal biocontainment lid. Rotor catalog number: 75003424
13 x 100 glass test tube (silanized)*	53283-800	VWR	13 x 100 mm borosilicate glass test tubes with screw-cap finish
Caps for glass test tubes	14-930-15D	ThermoFisher Scientific	Kimble™ Black Phenolic Screw Caps; 13mm-415 GPI thread; PTFE-faced rubber liner.
Sodium chloride	S7653	Sigma-Aldrich	>99.5% pure
Chloroform	4440-08	Macron Fine Chemicals
Trifluoroacetic acid	299537	Sigma-Aldrich	99% purified by redistillation for protein sequencing
Sodium borohydride	71321	Fluka Analytical	99%
Ammonium hydroxide solution	320145	Sigma-Aldrich	NH3 content: 28.0 – 30.0%
Methanol	AH230-4	Honeywell Burdick & Jackson	HPLC grade
Acetic acid	320099	Sigma-Aldrich	99.70%
Plastic vacuum desiccator	Any model of adequate size	FoodSaver
Acetic anhydride	539996	Sigma-Aldrich	99.50%
Dichloromethane	D143SK-4	ThermoFisher Scientific	Stabilized HPLC grade
Acetone	9006-03	J.T.Baker	Baker Analyzed
Heated evaporation manifold (main unit)	pi18823	ThermoFisher Scientific	Thermo Scientific* Reacti-Therm* Heating and Stirring Module; Triple-block Model with Heating and Stirring Function
Heated evaporation manifold (overhead evaporator)	pi18826	ThermoFisher Scientific	ThermoScientific* Reacti-Vap Evaporator, 27-port; For use with triple-block Reacti-Therm heating module
Aluminum sample-holder blocks for evaporation manifold	pi18816	ThermoFisher Scientific	Block, Aluminum, Reacti-Block S-1, Holds 13mm dia test tubes, 13 holes (14 dia. x 45mm deep)
Gas chromatograph	Model A7890	Agilent	Equipped with CTC PAL autosampler
Mass spectrometer	GCT Premier (Time-of-Flight)	Waters
Split-mode liner (deactivated / silanized)	5183-4647	Agilent	Containing a small plug of silanized glass wool
DB-5ms GC column	122-5532	Agilent	30 m x 0.25 mm ID x 0.25 micron film thickness
Chlorotrimethylsilane	95541	Sigma-Aldrich
Glass vacuum desiccator (for glassware silanization)	EW-06536-30	Cole-Parmer	12" wide; 230 mm plate size
*Glassware silanization is carried out in-house, overnight using chlorotrimethylsilane vapor in a large glass vacuum desiccator.