Glycan Узел Анализ: снизу вверх подход к Glycomics

Summary

This article presents an enhanced form of a novel bottom-up glycomics technique designed to analyze the pooled compositional profile of glycans in unfractionated biofluids through the chemical breakdown of glycans into their constituent linkage-specific monosaccharides for detection by GC-MS. Potential applications include early detection of cancer and other glycan-affective disorders.

Abstract

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and extracellular events. Many pathological conditions, notably cancer, affect gene expression, which can in turn deregulate the relative abundance and activity levels of glycoside hydrolase and glycosyltransferase enzymes. Unique aberrant whole glycans resulting from deregulated glycosyltransferase(s) are often present in trace quantities within complex biofluids, making their detection difficult and sometimes stochastic. However, with proper sample preparation, one of the oldest forms of mass spectrometry (gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS) can routinely detect the collection of branch-point and linkage-specific monosaccharides (“glycan nodes”) present in complex biofluids. Complementary to traditional top-down glycomics techniques, the approach discussed herein involves the collection and condensation of each constituent glycan node in a sample into a single independent analytical signal, which provides detailed structural and quantitative information about changes to the glycome as a whole and reveals potentially deregulated glycosyltransferases. Improvements to the permethylation and subsequent liquid/liquid extraction stages provided herein enhance reproducibility and overall yield by facilitating minimal exposure of permethylated glycans to alkaline aqueous conditions. Modifications to the acetylation stage further increase the extent of reaction and overall yield. Despite their reproducibility, the overall yields of N-acetylhexosamine (HexNAc) partially permethylated alditol acetates (PMAAs) are shown to be inherently lower than their expected theoretical value relative to hexose PMAAs. Calculating the ratio of the area under the extracted ion chromatogram (XIC) for each individual hexose PMAA (or HexNAc PMAA) to the sum of such XIC areas for all hexoses (or HexNAcs) provides a new normalization method that facilitates relative quantification of individual glycan nodes in a sample. Although presently constrained in terms of its absolute limits of detection, this method expedites the analysis of clinical biofluids and shows considerable promise as a complementary approach to traditional top-down glycomics.

Introduction

Гликолипиды, гликопротеины, протеогликаны и гликозаминогликаны представляют собой четыре основных класса сложных гетерогенных углеводов под общим названием гликанов. Как вездесущие и неотъемлемыми компонентами плазматической мембраны, гликокаликсом и внеклеточного матрикса и жидкостей, гликаны принять участие в таких разнообразных биохимических процессов как эндоцитоза, внутриклеточного транспорта, подвижности клеток, трансдукции сигнала, молекулярного распознавания, активации рецептора, клеточной адгезии, хозяин-патоген взаимодействия , связь, иммунологического и иммунной инициация межклеточное ответ. ¹ Present почти в каждой области жизни, ферменты , известные как гликозилтрансферазами , которые строят гликанов полимеры действуют в тандеме с гликозидных гидролаз (также известный как гликозидазы, расщепляющих гликаны) построить, реконструируют, и в конечном счете производят окончательно гликанов полимеров ^2. Хотя каждая гликозилтрансферазу может работать на разных гликоконъюгатами, гликозилтрансферазукак правило , кует linkage- и аномера специфические гликозидной связь путем передачи моносахаридную фрагмент определенного активированного нуклеотидного сахарного донора (например, ВВП-фукозы) к определенной категории нуклеофильных акцепторов (например, липидами, полипептида, нуклеиновой кислоты, или растет олигосахарид). Было подсчитано , что более 50% белков (особенно мембранных и секреторных белков) являются посттрансляционно модифицированный гликозилирования ³ Элементарные комбинаторные расчеты дают высокую оценку значительной изменчивости, универсальности и специфичности, оказанное гликопротеинов гликозилирования. например, если полипептид субстрат имеет только 10 сайтов гликозилирования , и каждый узел может образовывать гликозидной связи с 1 из только 3 -х различных моносахаридов восстанавливающих концах, то, теоретически, окончательный гликопротеин можно предположить , 3 ¹⁰ = 59049 отличные тождества. В гликопротеинов, гликозидных связей обычно образуют с боковой цепи азота OF аспарагина в последовательности Asn-X-Ser / Thr , (Х может быть любой аминокислотой , за исключением пролина) с получением N -glycans ² и боковой цепи гидроксильные группы серина и треонина с получением O -glycans ^4. Состав glycome содержимым ячейки (то есть, его дополнение гликозилирования продуктов) является уникальным и ограниченным , потому что, за немногими исключениями, гликозилтрансфераз проявляют строгую донор, акцептор, и рычажный специфичность. ⁵ Важные и обильные плазмы крови гликопротеинов страдают аномальным гликозилирование как нижестоящий следствие аномальной экспрессии гликозилтрансферазной и активности из – за многих патологических состо ний , особенно рака и воспалительных заболеваний. ^6-24

В основном за счет эпигенетических факторов glycome значительно более разнообразным, динамичным и сложным , чем протеома и транскриптом. ^25,26 В то время как примерно 1% генома млекопитающих кодирует образование, модификацию исборка гликанах, ²⁷ гликозилирования протекает в нешаблонном-ориентировкой-заметному отличие от полипептида и биосинтез нуклеиновых кислот. Взаимодействие между относительного количества и активности ферментов гликозилирования и таких экологических факторов , как питательных веществ и прекурсоров доступности в конечном счете , определяет характер, скорость и степень гликозилирования. ^5,28 эмбриогенез (например, определение и дифференциация), клеточная активация, и прогрессия через экспрессия гена влияния клеточного цикла (т.е., транскрипции и трансляции) и изменить характер и количество доступных гликозилтрансферазами, чья активность является непосредственным фактором , определяющим перед гликановой профилем клетки. Потому что (некоторые) пролиферативные, клей и инвазивные свойства раковых клеток напоминают обычные эмбриогенные клетки, специфические изменения в гликанов биосинтетических путей (например, накопление предшественника, дерегулирование экспрессии, aberranт модификация, структурная усечение, или роман формирования) служат универсальные биомаркеры рака , которые указывают на различные этапы формирования опухоли, прогрессии, миграции и инвазии ²⁹ Хотя гликозилирования является очень сложным, очевидно , лишь немногие изменения в гликозилирования могут позволить канцерогенеза и метастазирования. по- видимому, некоторые "аномальным" гликозилирования продукты действительно выгоду раковые клетки, позволяя им уклоняться от иммунной признания и выжить требования миграции в негостеприимных внутрисосудистых и метастатических средах. ^28,30,31 Не удивительно, что эксперименты показали , что нарушения или предотвращения моделей изменены экспрессии генов и аберрантное гликан образование может остановить туморогенез. ²⁹ Тем не менее, отклоняющиеся гликаны , обнаруженные в биожидкости образце (например, моча, слюна, и плазмы крови или сыворотки) не могут быть прямыми индикаторами рака (или другое заболевание), а скорее вниз по течению результаты тонкий, но значительнаяизменения в иммунной системе или количественному разветвлений пагубного состояния в непредсказуемом органе. ³²

Несмотря на то, что они обеспечивают универсальную информацию о glycome, много молекулярных методов взаимодействия на основе glycomics (например, лектин / массивы антител и метаболические / ковалентную маркировка) зависит от обнаружения целых структур гликанов и не обеспечивают подробную структурную информацию об отдельных гликанов. В противоположность, масс-спектрометрия (МС) может помочь идентифицировать и количественно отдельных гликанов структур и выявить такую ​​структурную информацию в качестве крепежных участков к полипептидных сердечников. Дерегулируемых экспрессию или активность только одного гликозилтрансферазы может инициировать каскад вредных молекулярных событий в нескольких путей гликозилирования. Поскольку каждый гликозилтрансферазу может работать на более чем одной гликоконъюгации подложки и в различных растущих гликанов полимеров, дерегулирование биосинтетические каскады выход disproporционно повышенное количество только одного гликановой продукта , но несколько разнородных классов аберрантных гликанов в интра- или внеклеточных жидкостей. ³³ Тем не менее, такие уникальные аберрантных гликаны иногда считается непрактичным в качестве биомаркеров для рака или других гликанов-аффективных патологий , так как , по сравнению с большим бассейном хорошо регулируется гликаны, эти отклоняющиеся гликаны представляют собой очень малую часть, которая часто может оставаться незаметного даже такими высокочувствительными методами, как масс-спектрометрии. Например, в внутри- и внеклеточной жидкости организма, спектр широкого белка концентрация (которая охватывает восемь порядков) может предотвратить обнаружение дефицитных гликопротеинов, которые замаскированы более распространенных видов. ³² Кроме того, определение гликозилтрансферазной активности остается значительным практическим и теоретическая проблема , потому что многие гликозилтрансферазы отсутствуют в клинических biofluids или становятся неактивными ех естественных условиях. Несмотря на всю сложность состоялоTLY обнаружения и количественной оценки ультра-малых количеств уникальных целых гликанах, практиков масс-спектрометрии добились огромных успехов в направлении применения нетронутыми гликаны как клинических маркеров. Недавно мы разработали дополнительный подход к анализу интактных гликанов, что, используя GC-MS, облегчает обнаружение всех учредительного точку ветвления и рычажный специфических моносахаридов ( "гликановые узлов"), которые в совокупности придают пищевым уникальность каждого Гликан и во многих случаи непосредственно служат в качестве молекулярных суррогаты, которые количественно относительную активность виновном гликозилтрансферазы (ов).

Так как его впервые сообщили непосредственное применение к гликановой анализу в 1958 году, газовой хроматографии (ГХ) доказала мощный метод для анализа каждого-метилированных моно- и дисахаридов, ³⁴ определяют их anomericity и абсолютную конфигурацию, и отделить их для последующего масс – спектрометрического анализа. ³⁵ В период с 1984 по 2007, Ciucanu и коллегвведена и уточнена твердофазного технику Гликан permethylation, применяемому гидроксид натрия и йодистый метил, а затем путем экстракции жидкость / жидкость перметилированных гликанов с использованием воды и хлороформа. ^35,36 В период с 2005 по 2008 год, Кан и его коллеги интегрировали экономии времени спин -column подход в стадию permethylation. ^37,38 в 2008 году исследовательская группа Гетц разработал количественную твердофазного permethylation методом гликан-профилирование с помощью матричной лазерной десорбцией-ионизацией (MALDI) масс – спектрометрии для сравнения и потенциально различать инвазивной и не -invasive клетки рака молочной железы; ³⁹ затем, в 2009 году команда Гетц в сочетании ферментативная и методы химического высвобождения расщеплять O -glycans из неповрежденных гликопротеинов в сильно щелочном схеме permethylation твердофазного ⁴⁰ Хотя процедура Гетц способствовала одновременно permethylation и высвобождения химических реагентов. из -glycans O, он был применен только к предварительно изолированных Glycoбелки. Мы модифицировали эту методику в 2013 году и адаптировать его для целых нефракционированного biofluids и образцов гомогенизированных тканей путем включения трифторуксусной кислоты (ТФК) гидролиз, восстановление и ацетилирование шаги. ³³ Эти дополнительные шаги также выпуск гликаны из гликолипидов и N -связанной гликаны из гликопротеинов и конвертировать их в частично метилированных полиолов ацетатов (PMAAs, рисунок 1), чьи отличительные узоры метилирования и-ацетилирование облегчают анализ с помощью ГХ-МС и однозначно характеризуют составляющие гликанов узлы в оригинальной неповрежденной гликановой полимера ⁴¹ (рисунок 2). ³³ в конечном счете, это процедура производит композиционный портрет всех гликанов в сложном биожидкости основанный на прямом, относительной количественной оценки уникальных гликанов функций, таких как «ядро фукозилирования», «6-сиалилирования", "рассекает GlcNAc" и "бета-1-6 ветвление" – каждый полученный из одного ГХ-МС chromatograpик пика. В данной статье представлены дальнейшую оптимизацию permethylation, ацетилирование, изоляцию и очистке этапы наряду с улучшениями в режиме относительной количественной оценки.

Protocol

Внимание: Избегать контакта с кожей / зрительный контакт с любым из реагентов , используемых в этом эксперименте. После экспозиции, тщательно промойте пораженный участок водой и немедленно обратитесь к врачу. 1. Permethylation и Glycan Добыча Подготовка колонки П?…

Representative Results

Ток Хроматограмма ионов общей (TIC) показывает успешный permethylation гидролиз, восстановление и ацетилирования образцов плазмы крови человека по отношению к случаям , в которых были выполнены неправильно два важных шага permethylation показаны на рисунке 3. <p class="jove_content…

Discussion

В целом, успешное производство частично метилированных полиолов ацетатов (PMAAs) от гексозы чревато меньшими трудностями и более надежна , чем успешного производства N -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs. Точный механизм этого явления позади , как он играет на каждом этапе этой процедуры неизвестна, н?…

Materials

Sodium hydroxide beads	367176	Sigma-Aldrich	20-40 mesh, reagent grade 97%
0.9 mL Spin column	69705	Pierce division of ThermoFisher Scientific	Includes  plugs and polyethylene frits
GC-MS autosampler vial (silanized)*	C4000-9	ThermoFisher Scientific	Target DP High Recovery Vial, 1.5 mL, 12 x 32 mm, Includes Teflon-lined pierceable caps
1.5 mL polypropylene test tubes	05-402-25	ThermoFisher Scientific	Snap-cap lid
2 mL polypropylene test tubes	05-408-138	ThermoFisher Scientific	Snap-cap lid
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	D8418	Sigma-Aldrich	BioReagent for molecular biology, reagent grade >99.0%
Iodomethane	I8507	Sigma-Aldrich	Contains copper as stabilizer, ReagentPlus 99%
Acetonitrile	A955-4	ThermoFisher Scientific	Optima LC/MS
Microcentrifuge	75002436: Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge	ThermoFisher Scientific	24 x 1.5/2.0 rotor with ClickSeal biocontainment lid. Rotor catalog number: 75003424
13 x 100 glass test tube (silanized)*	53283-800	VWR	13 x 100 mm borosilicate glass test tubes with screw-cap finish
Caps for glass test tubes	14-930-15D	ThermoFisher Scientific	Kimble™ Black Phenolic Screw Caps; 13mm-415 GPI thread; PTFE-faced rubber liner.
Sodium chloride	S7653	Sigma-Aldrich	>99.5% pure
Chloroform	4440-08	Macron Fine Chemicals
Trifluoroacetic acid	299537	Sigma-Aldrich	99% purified by redistillation for protein sequencing
Sodium borohydride	71321	Fluka Analytical	99%
Ammonium hydroxide solution	320145	Sigma-Aldrich	NH3 content: 28.0 – 30.0%
Methanol	AH230-4	Honeywell Burdick & Jackson	HPLC grade
Acetic acid	320099	Sigma-Aldrich	99.70%
Plastic vacuum desiccator	Any model of adequate size	FoodSaver
Acetic anhydride	539996	Sigma-Aldrich	99.50%
Dichloromethane	D143SK-4	ThermoFisher Scientific	Stabilized HPLC grade
Acetone	9006-03	J.T.Baker	Baker Analyzed
Heated evaporation manifold (main unit)	pi18823	ThermoFisher Scientific	Thermo Scientific* Reacti-Therm* Heating and Stirring Module; Triple-block Model with Heating and Stirring Function
Heated evaporation manifold (overhead evaporator)	pi18826	ThermoFisher Scientific	ThermoScientific* Reacti-Vap Evaporator, 27-port; For use with triple-block Reacti-Therm heating module
Aluminum sample-holder blocks for evaporation manifold	pi18816	ThermoFisher Scientific	Block, Aluminum, Reacti-Block S-1, Holds 13mm dia test tubes, 13 holes (14 dia. x 45mm deep)
Gas chromatograph	Model A7890	Agilent	Equipped with CTC PAL autosampler
Mass spectrometer	GCT Premier (Time-of-Flight)	Waters
Split-mode liner (deactivated / silanized)	5183-4647	Agilent	Containing a small plug of silanized glass wool
DB-5ms GC column	122-5532	Agilent	30 m x 0.25 mm ID x 0.25 micron film thickness
Chlorotrimethylsilane	95541	Sigma-Aldrich
Glass vacuum desiccator (for glassware silanization)	EW-06536-30	Cole-Parmer	12" wide; 230 mm plate size
*Glassware silanization is carried out in-house, overnight using chlorotrimethylsilane vapor in a large glass vacuum desiccator.