Glycan Nodo Analisi: un approccio bottom-up per Glycomics

Summary

This article presents an enhanced form of a novel bottom-up glycomics technique designed to analyze the pooled compositional profile of glycans in unfractionated biofluids through the chemical breakdown of glycans into their constituent linkage-specific monosaccharides for detection by GC-MS. Potential applications include early detection of cancer and other glycan-affective disorders.

Abstract

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and extracellular events. Many pathological conditions, notably cancer, affect gene expression, which can in turn deregulate the relative abundance and activity levels of glycoside hydrolase and glycosyltransferase enzymes. Unique aberrant whole glycans resulting from deregulated glycosyltransferase(s) are often present in trace quantities within complex biofluids, making their detection difficult and sometimes stochastic. However, with proper sample preparation, one of the oldest forms of mass spectrometry (gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS) can routinely detect the collection of branch-point and linkage-specific monosaccharides (“glycan nodes”) present in complex biofluids. Complementary to traditional top-down glycomics techniques, the approach discussed herein involves the collection and condensation of each constituent glycan node in a sample into a single independent analytical signal, which provides detailed structural and quantitative information about changes to the glycome as a whole and reveals potentially deregulated glycosyltransferases. Improvements to the permethylation and subsequent liquid/liquid extraction stages provided herein enhance reproducibility and overall yield by facilitating minimal exposure of permethylated glycans to alkaline aqueous conditions. Modifications to the acetylation stage further increase the extent of reaction and overall yield. Despite their reproducibility, the overall yields of N-acetylhexosamine (HexNAc) partially permethylated alditol acetates (PMAAs) are shown to be inherently lower than their expected theoretical value relative to hexose PMAAs. Calculating the ratio of the area under the extracted ion chromatogram (XIC) for each individual hexose PMAA (or HexNAc PMAA) to the sum of such XIC areas for all hexoses (or HexNAcs) provides a new normalization method that facilitates relative quantification of individual glycan nodes in a sample. Although presently constrained in terms of its absolute limits of detection, this method expedites the analysis of clinical biofluids and shows considerable promise as a complementary approach to traditional top-down glycomics.

Introduction

Glicolipidi, glicoproteine, proteoglicani, glicosaminoglicani e costituiscono i quattro classi principali di complessi carboidrati eterogenee noti collettivamente come glicani. Come componenti onnipresenti e integrali della membrana plasmatica, glicocalice, e la matrice extracellulare e fluidi, glicani partecipano in questi diversi processi biochimici come l'endocitosi, traffico intracellulare, motilità cellulare, trasduzione del segnale, riconoscimento molecolare, l'attivazione del recettore, adesione cellulare, l'interazione ospite-patogeno , intercellulare comunicazione, immunosorveglianza, e l'iniziazione risposta immunitaria. ¹ Presente in quasi tutti i campi della vita, enzimi noti come glicosiltransferasi che costruiscono i polimeri glycan agire in tandem con glicosidasi (noto anche come glicosidasi, che abbattere glicani) per la costruzione, ristrutturazione, e infine produrre polimeri finalizzato glycan ^2. Anche se ogni glycosyltransferase può operare su diversi glicoconiugati, un glycosyltransferasegeneralmente forgia una sul sollevatore e anomero specifico legame glicosidico trasferendo la frazione monosaccaride di un particolare nucleotide attivato zucchero donatore (ad esempio, il PIL-fucose) per una determinata categoria di accettori nucleofili (ad esempio, un lipide, polipeptide, acidi nucleici, o la coltivazione oligosaccaride). È stato stimato che più del 50% di proteine ​​(specie di membrana e proteine ​​secretorie) sono post-traduzionali modificato glicosilazione ³ calcoli combinatori rudimentali prevedono un apprezzamento per la notevole variabilità, versatilità, e specificità riconosciuta alle glicoproteine ​​di glicosilazione.; per esempio, se un substrato polipeptide ha solo 10 siti di glicosilazione e ogni sito può formare un legame glicosidico con 1 di soli 3 diversi monosaccaridi estremità riducenti, teoricamente, la glicoproteina finale può assumere 3 ¹⁰ = 59.049 identità distinte. In glicoproteine, legami glicosidici comunemente formano con la catena laterale di azoto oresidui f asparagina nella sequenza Asn-X-Ser / Thr (X può essere qualsiasi aminoacido prolina tranne) per produrre N -glycans ² e della catena laterale idrossili di residui di serina e treonina per produrre O -glycans ^4. La composizione di glycome di una cellula (ad esempio, il suo complemento dei prodotti di glicosilazione) è unico e limitato perché, con poche eccezioni, glicosiltransferasi mostrano donatore rigorosa, accettore, e il collegamento specificità. ⁵ glicoproteine ​​importanti e abbondanti plasma sanguigno soffrono glicosilazione aberrante come conseguenza a valle di espressione glycosyltransferase anormale e l'attività a causa di molte condizioni patologiche, in particolare il cancro e le malattie infiammatorie. ^6-24

Principalmente a causa di fattori epigenetici, il glycome è significativamente più diversificata, dinamica e complessa di quella del proteoma e del trascrittoma. ^25,26 Mentre circa l'1% del genoma dei mammiferi codifica la formazione, la modifica emontaggio di glicani, ²⁷ procede di glicosilazione in un non-template-driven modo, un contrasto marcato per polipeptide e la biosintesi degli acidi nucleici. L'interazione tra la quantità relativa e l'attività degli enzimi di glicosilazione e fattori ambientali come la disponibilità di nutrienti e precursore in ultima analisi, determina la natura, la frequenza e l'estensione di glicosilazione. ^5,28 Embriogenesi (ad esempio, la determinazione e la differenziazione), attivazione cellulare, e la progressione attraverso l'espressione genica influenza ciclo cellulare (cioè, trascrizione e traduzione) e modificare l'identità e la quantità di glicosiltrasferasi disponibili, la cui attività è il determinante monte immediata del profilo glycan della cellula. Perché (alcuni dei) del proliferativa, adesivi, e le proprietà invasive di cellule cancerose sono simili a quelle delle cellule embrioniche ordinarie, modifiche del vie biosintetiche glycan (ad esempio, l'accumulo di precursore, espressione deregolamentato, aberrant modifica, troncamento strutturale, o la formazione di romanzo) servono biomarcatori tumorali come universali che indicano varie fasi di formazione del tumore, la progressione, la migrazione e l'invasione ²⁹ Anche se la glicosilazione è molto complesso, evidentemente, solo poche alterazioni glicosilazione possono abilitare la carcinogenesi e metastasi.; a quanto pare, alcuni prodotti di glicosilazione "aberranti" infatti beneficiare cellule cancerose, consentendo loro di eludere il riconoscimento immunitario e sopravvivere alle esigenze di migrazione in ambienti intravascolari e metastatici inospitali. ^28,30,31 Non sorprendentemente, gli esperimenti hanno rivelato che interrompere o prevenire modelli di alterata l'espressione genica e la formazione glycan aberranti possono fermare tumorigenesi. ²⁹ Tuttavia, i glicani aberranti rilevati in un campione BIOFLUID (ad esempio, urina, saliva, e plasma sanguigno o siero) non possono essere indicatori diretti di cancro (o un'altra malattia), ma piuttosto a valle esiti di sottile ma significativocambiamenti nel sistema immunitario o ramificazioni quantificabili di una condizione perniciosa in un organo imprevedibile. ³²

Anche se forniscono informazioni circa l'universale glycome, molti molecolari glicomica interazione basati su tecniche (ad esempio, lectina / array di anticorpi e metabolico / etichettatura covalente) dipenderà l'individuazione di strutture intere glycan e non forniscono informazioni strutturali dettagliate sui singoli glicani. In netto contrasto, la spettrometria di massa (MS) può aiutare a identificare e quantificare singole strutture glycan e rivelare tali informazioni strutturali come i siti di attacco per core polipeptide. dell'espressione o dell'attività di un solo glicosiltrasferasi deregolamentato possono iniziare una cascata di eventi molecolari dannosi in molteplici vie glicosilazione. Poiché ogni glycosyltransferase può operare su più di un substrato glicoconiugati e tra i diversi polimeri glycan crescita, cascate biosintetici liberalizzati resa disproporzionale maggiore quantità di un solo prodotto glicani ma diverse classi eterogenee di glicani aberranti nei fluidi intra o extracellulare. ³³ Tuttavia, tali glicani aberranti unici sono a volte considerati poco pratico come biomarcatori per il cancro o altre patologie glycan-affettiva perché, rispetto alla grande piscina di glicani ben regolamentata, questi glicani aberranti rappresentano una frazione molto piccola che possono spesso rimangono rilevabili anche da tecniche come altamente sensibili come la spettrometria di massa. Ad esempio, nei fluidi corporei intra ed extracellulari, l'ampio spettro proteina-concentrazione (che attraversa otto ordini di grandezza) può impedire il rilevamento di glicoproteine ​​scarse mascherati dalle specie più abbondanti. ³² Inoltre, la determinazione dell'attività glycosyltransferase rimane una notevole pratica e la sfida teorica perché molti glicosiltransferasi sono assenti in biofluidi clinici o diventare inattivo ex vivo. Nonostante la difficoltà di consistently rilevare e quantificare le quantità ultra-minuti di glicani tutto unico, praticanti di spettrometria di massa hanno fatto enormi passi avanti verso l'impiego glicani intatti come marcatori clinici. Abbiamo recentemente sviluppato un approccio complementare all'analisi dei glicani intatte che, impiegando GC-MS, facilita il rilevamento di tutti branch-point costituente e monosaccaridi specifici di collegamento ( "nodi glicani") che insieme conferiscono unicità ad ogni glicani e in molti casi servono direttamente surrogati come molecolari che quantificano l'attività relativa del glycosyltransferase colposo (s).

Fin dalla sua prima applicazione diretta riferito all'analisi glicani nel 1958, gascromatografia (GC) ha dimostrato una tecnica potente per l'analisi per-metilato mono e disaccaridi, ³⁴ determinare la loro anomericity e configurazione assoluta, e separarli per la successiva analisi di spettrometria di massa. ³⁵ tra il 1984 e il 2007, Ciucanu e colleghiintrodotto e affinato una tecnica glycan permethylation in fase solida che ha impiegato idrossido di sodio e iodometano, seguita da estrazione liquido / liquido di glicani permethylated con acqua e cloroformio. ^35,36 Tra il 2005 e il 2008, Kang e collaboratori integrati un risparmio di tempo di rotazione approccio -column nella fase permethylation. ^37,38 nel 2008, il gruppo di ricerca Goetz messo a punto un solido-fase quantitativa permethylation metodo glycan-profiling usando matrix-assisted laser desorbimento-ionizzazione (MALDI) spettrometria di massa per confrontare e distinguere invasiva e non potenzialmente non invasiva delle cellule del cancro al seno; ³⁹ poi, nel 2009, il team di Goetz combinato enzimatica e tecniche di rilascio di sostanze chimiche per fendere O -glycans da glicoproteine ​​intatte in uno schema permethylation in fase solida altamente alcalini ⁴⁰ Anche se la procedura di Goetz facilitato permethylation simultanea e rilascio di sostanze chimiche. di -glycans O, è stato applicato solo alle pre-isolata glicoproteine. Abbiamo modificato questa tecnica nel 2013 e adattato per intere biofluidi non frazionate e campioni di tessuto omogeneizzati incorporando acido trifluoroacetico (TFA) idrolisi, riduzione e acetilazione passi. ³³ Questi passaggi aggiuntivi anche rilasciare glicani da glicolipidi e N -linked glicani da glicoproteine ​​e convertire li in acetati parzialmente metilati alditolo (PMAAs, Figura 1), il cui pattern di metilazione-and-acetilazione distintivo facilitare l'analisi mediante GC-MS e unicamente caratterizzare i nodi glicani costituenti in originale intatta polimero glicani ⁴¹ (Figura 2). ³³ in definitiva, questo procedura produce un ritratto composito di tutti i glicani in un complesso a base di BIOFLUID diretta, quantificazione relativa di caratteristiche uniche come glycan "fucosilazione core", "6-sialylation", "bisettrice GlcNAc", e "beta 1-6 ramificazione" – ogni deriva da un unico chromatograp GC-MSpicco hic. Questo articolo presenta un'ulteriore ottimizzazione della permethylation, acetilazione, l'isolamento, e le fasi di pulizia insieme con il miglioramento della modalità di quantificazione relativa.

Protocol

Attenzione: evitare il contatto della pelle / degli occhi con uno qualsiasi dei reagenti utilizzati in questo esperimento. Al momento dell'esposizione, sciacquare a fondo l'area interessata con acqua e consultare un medico immediato. 1. Permethylation e Glycan Estrazione Preparazione colonna Ottenere un numero di unità di colonne microcentrifuga rotazione come i campioni da analizzare. Rompere e staccare i tappi tubo serbatoio in plastica. Mettere un…

Representative Results

Un cromatogramma corrente ionica totale (TIC) mostrando permethylation successo, idrolisi, riduzione e acetilazione dei campioni di plasma umano rispetto ai casi in cui sono state eseguite correttamente due passi permethylation critici sono mostrati in Figura 3. Assoluta Resa HexNAcs relativa a esosi: N -acetylhexosamine (HexNAc) a…

Discussion

In generale, la produzione di successo di acetati alditolo parzialmente denaturato (PMAAs) da esosi è irto di difficoltà meno ed è più robusto rispetto alla produzione di successo di N -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs. L'esatto meccanismo dietro questo fenomeno in quanto svolge in ogni fase di questa procedura è sconosciuta, ma deve riferirsi alla chimica unica del gruppo acetil N (anziché gruppo ossidrile) che è unico per HexNAcs rispetto al esosi. Il meccanismo dietro questo fenomeno si ri…

Materials

Sodium hydroxide beads	367176	Sigma-Aldrich	20-40 mesh, reagent grade 97%
0.9 mL Spin column	69705	Pierce division of ThermoFisher Scientific	Includes  plugs and polyethylene frits
GC-MS autosampler vial (silanized)*	C4000-9	ThermoFisher Scientific	Target DP High Recovery Vial, 1.5 mL, 12 x 32 mm, Includes Teflon-lined pierceable caps
1.5 mL polypropylene test tubes	05-402-25	ThermoFisher Scientific	Snap-cap lid
2 mL polypropylene test tubes	05-408-138	ThermoFisher Scientific	Snap-cap lid
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	D8418	Sigma-Aldrich	BioReagent for molecular biology, reagent grade >99.0%
Iodomethane	I8507	Sigma-Aldrich	Contains copper as stabilizer, ReagentPlus 99%
Acetonitrile	A955-4	ThermoFisher Scientific	Optima LC/MS
Microcentrifuge	75002436: Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge	ThermoFisher Scientific	24 x 1.5/2.0 rotor with ClickSeal biocontainment lid. Rotor catalog number: 75003424
13 x 100 glass test tube (silanized)*	53283-800	VWR	13 x 100 mm borosilicate glass test tubes with screw-cap finish
Caps for glass test tubes	14-930-15D	ThermoFisher Scientific	Kimble™ Black Phenolic Screw Caps; 13mm-415 GPI thread; PTFE-faced rubber liner.
Sodium chloride	S7653	Sigma-Aldrich	>99.5% pure
Chloroform	4440-08	Macron Fine Chemicals
Trifluoroacetic acid	299537	Sigma-Aldrich	99% purified by redistillation for protein sequencing
Sodium borohydride	71321	Fluka Analytical	99%
Ammonium hydroxide solution	320145	Sigma-Aldrich	NH3 content: 28.0 – 30.0%
Methanol	AH230-4	Honeywell Burdick & Jackson	HPLC grade
Acetic acid	320099	Sigma-Aldrich	99.70%
Plastic vacuum desiccator	Any model of adequate size	FoodSaver
Acetic anhydride	539996	Sigma-Aldrich	99.50%
Dichloromethane	D143SK-4	ThermoFisher Scientific	Stabilized HPLC grade
Acetone	9006-03	J.T.Baker	Baker Analyzed
Heated evaporation manifold (main unit)	pi18823	ThermoFisher Scientific	Thermo Scientific* Reacti-Therm* Heating and Stirring Module; Triple-block Model with Heating and Stirring Function
Heated evaporation manifold (overhead evaporator)	pi18826	ThermoFisher Scientific	ThermoScientific* Reacti-Vap Evaporator, 27-port; For use with triple-block Reacti-Therm heating module
Aluminum sample-holder blocks for evaporation manifold	pi18816	ThermoFisher Scientific	Block, Aluminum, Reacti-Block S-1, Holds 13mm dia test tubes, 13 holes (14 dia. x 45mm deep)
Gas chromatograph	Model A7890	Agilent	Equipped with CTC PAL autosampler
Mass spectrometer	GCT Premier (Time-of-Flight)	Waters
Split-mode liner (deactivated / silanized)	5183-4647	Agilent	Containing a small plug of silanized glass wool
DB-5ms GC column	122-5532	Agilent	30 m x 0.25 mm ID x 0.25 micron film thickness
Chlorotrimethylsilane	95541	Sigma-Aldrich
Glass vacuum desiccator (for glassware silanization)	EW-06536-30	Cole-Parmer	12" wide; 230 mm plate size
*Glassware silanization is carried out in-house, overnight using chlorotrimethylsilane vapor in a large glass vacuum desiccator.