Glycan Analyse Node: une approche bottom-up à Glycomics

Summary

This article presents an enhanced form of a novel bottom-up glycomics technique designed to analyze the pooled compositional profile of glycans in unfractionated biofluids through the chemical breakdown of glycans into their constituent linkage-specific monosaccharides for detection by GC-MS. Potential applications include early detection of cancer and other glycan-affective disorders.

Abstract

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and extracellular events. Many pathological conditions, notably cancer, affect gene expression, which can in turn deregulate the relative abundance and activity levels of glycoside hydrolase and glycosyltransferase enzymes. Unique aberrant whole glycans resulting from deregulated glycosyltransferase(s) are often present in trace quantities within complex biofluids, making their detection difficult and sometimes stochastic. However, with proper sample preparation, one of the oldest forms of mass spectrometry (gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS) can routinely detect the collection of branch-point and linkage-specific monosaccharides (“glycan nodes”) present in complex biofluids. Complementary to traditional top-down glycomics techniques, the approach discussed herein involves the collection and condensation of each constituent glycan node in a sample into a single independent analytical signal, which provides detailed structural and quantitative information about changes to the glycome as a whole and reveals potentially deregulated glycosyltransferases. Improvements to the permethylation and subsequent liquid/liquid extraction stages provided herein enhance reproducibility and overall yield by facilitating minimal exposure of permethylated glycans to alkaline aqueous conditions. Modifications to the acetylation stage further increase the extent of reaction and overall yield. Despite their reproducibility, the overall yields of N-acetylhexosamine (HexNAc) partially permethylated alditol acetates (PMAAs) are shown to be inherently lower than their expected theoretical value relative to hexose PMAAs. Calculating the ratio of the area under the extracted ion chromatogram (XIC) for each individual hexose PMAA (or HexNAc PMAA) to the sum of such XIC areas for all hexoses (or HexNAcs) provides a new normalization method that facilitates relative quantification of individual glycan nodes in a sample. Although presently constrained in terms of its absolute limits of detection, this method expedites the analysis of clinical biofluids and shows considerable promise as a complementary approach to traditional top-down glycomics.

Introduction

Glycolipides, des glycoprotéines, des protéoglycanes et glycosaminoglycanes constituent les quatre principales classes d'hydrates de carbone, hétérogènes complexes collectivement appelés glycanes. En tant que composants omniprésents et intégrales de la membrane plasmique, glycocalyx, et de la matrice et des fluides extracellulaires, les glycanes participent à de tels procédés biochimiques divers que l'endocytose, le trafic intracellulaire, la motilité cellulaire, la transduction du signal, la reconnaissance moléculaire, l'activation du récepteur, l'adhésion cellulaire, l'interaction hôte-pathogène , la communication intercellulaire, immunosurveillance et immunitaire initiation de réponse. ¹ Présent dans presque tous les domaines de la vie, enzymes appelées glycosyltransférases qui construisent des polymères glycanes agissent en tandem avec glycoside hydrolases (également connu sous le nom glycosidases, qui décomposent les glycanes) pour construire, rénover, et , finalement , produire finalisé polymères glycanes ^2. Bien que chaque glycosyltransférase peut fonctionner sur différents glycoconjugués, une glycosyltransféraseforges généralement une liaison glycosidique linkage- et anomère spécifique en transférant le fragment monosaccharide d'un nucléotide activé donneur de sucre particulier (par exemple, GDP-fucose) à une certaine catégorie d'accepteurs nucléophiles (par exemple, un lipide, un polypeptide, un acide nucléique, ou de plus en plus oligosaccharide). Il a été estimé que plus de 50% de protéines ( en particulier membranaires et des protéines sécrétoires) sont post-traductionnelle modifié par glycosylation ³ calculs combinatoires rudimentaires fournissent une appréciation de la variabilité considérable, la polyvalence et la spécificité accordée aux glycoprotéines par glycosylation. Par exemple, si un substrat de polypeptide ne possède que 10 sites de glycosylation et chaque site peut former une liaison glycosidique avec une des extrémités réductrices seulement trois monosaccharides différents, alors, en principe, la glycoprotéine finale peut prendre ¹⁰ = 3 59049 identités distinctes. Dans les glycoprotéines, les liaisons glycosidiques forment communément avec la chaîne latérale d'azote of résidus d'asparagine dans la séquence Asn-X-Ser / Thr (X peut être un acide aminé quelconque excepté la proline) pour obtenir le N -glycans ² et des chaînes latérales hydroxyles des résidus de serine et de threonine pour donner -glycans O ^4. La composition du glycome d'une cellule ( par exemple, son complément de produits de glycosylation) est unique et limitée parce que, à quelques exceptions près, les glycosyltransférases présentent des donateurs stricte, accepteur, et la spécificité de liaison. ⁵ glycoprotéines de plasma sanguin importants et abondants souffrent glycosylation aberrante comme conséquence aval de l' expression de la glycosyltransférase et l' activité anormale due à de nombreux états pathologiques, en particulier le cancer et les maladies inflammatoires. ^6-24

Principalement en raison de facteurs épigénétiques, l'glycome est nettement plus diversifiée, dynamique et complexe que le protéome et du transcriptome. ^25,26 Alors qu'environ 1% du génome de mammifère code pour la formation, la modification, etEnsemble de glycanes, ²⁷ glycosylation se déroule de manière-un contraste marqué non orientés modèles de polypeptide et de la biosynthèse des acides nucléiques. L'interaction entre la quantité relative et l' activité des enzymes de glycosylation et des facteurs environnementaux tels que la disponibilité des nutriments et d'un précurseur détermine finalement la nature, le taux et l' étendue de la glycosylation. ^5,28 embryogenèse (par exemple, la détermination et de la différenciation), l' activation cellulaire et la progression à travers l'expression de l' influence du gène de cycle cellulaire ( par exemple, la transcription et la traduction) et modifier l'identité et la quantité des glycosyltransférases disponibles, dont l' activité est le facteur déterminant en amont immédiat du profil glycane de la cellule. Parce que (certains) le proliférative, adhésif, et les propriétés invasives des cellules cancéreuses ressemblent à celles des cellules embryogènes ordinaires, des changements spécifiques dans les voies de biosynthèse glycane (par exemple, l' accumulation de précurseur, l' expression dérégulée, aberrant modification, troncature structurelle ou formation roman) servent de biomarqueurs du cancer comme universels qui indiquent différentes étapes de la formation de tumeurs, la progression, la migration et l' invasion ²⁹ Bien que la glycosylation est très complexe, évidemment que quelques modifications de glycosylation peuvent permettre à la carcinogenèse et les métastases. apparemment, certains produits de glycosylation "aberrantes" en effet bénéficier des cellules cancéreuses en leur permettant de se soustraire à la reconnaissance immunitaire et de survivre aux exigences de la migration dans des environnements intravasculaires et métastatiques inhospitalières. ^28,30,31 Sans surprise, les expériences ont montré que la perturbation ou la prévention des motifs de changé l' expression génique et la formation glycane aberrante peuvent stopper la tumorigenèse. ²⁹ Néanmoins, les glycanes aberrantes détectées dans un échantillon de fluide biologique (par exemple, l' urine, la salive et le plasma ou le sérum sanguin) peuvent ne pas être des indicateurs directs de cancer (ou une autre maladie), mais plutôt en aval résultats de subtile mais significativedes changements dans le système immunitaire ou des ramifications quantifiables d'une condition pernicieuse dans un organe imprévisible. ³²

Bien qu'ils fournissent des informations universelles sur le glycome, de nombreux glycomique à base d'interaction-techniques moléculaires (par exemple, lectine / matrices d' anticorps et métabolique / marquage covalent) dépend de la détection de structures glycanniques entières et ne fournissent pas des informations structurelles détaillées sur glycanes individuelles. En contraste marqué, la spectrométrie de masse (MS) peut aider à identifier et quantifier les structures glycanniques individuelles et révéler de telles informations structurelles que les sites de fixation à noyaux polypeptidiques. l'expression ou l'activité d'une seule glycosyltransférase dérégulée peut initier une cascade d'événements moléculaires nuisibles dans de multiples voies de glycosylation. Parce que chaque glycosyltransférase peut fonctionner sur plus d'un substrat de glycoconjugué et à travers différents polymères glycanes croissance, cascades biosynthétiques déréglementés donnent dispropornellement des quantités accrues d'un seul produit glycane mais plusieurs classes hétérogènes de glycanes aberrantes dans les fluides intra- ou extracellulaires. ³³ Cependant, ces glycanes aberrants uniques sont parfois considérés comme peu pratique en tant que biomarqueurs pour le cancer ou d' autres pathologies glycanes-affectif parce que, par rapport à la grande piscine des glycanes bien réglementé, ces glycanes aberrantes représentent une très petite fraction qui peut souvent rester indétectable même par des techniques très sensibles comme la spectrométrie de masse. Par exemple, dans des fluides corporels intra- et extracellulaire, le large spectre de protéines de concentration (qui couvre huit ordres de grandeur) peut empêcher la détection de glycoprotéines rares qui sont masquées par les espèces les plus abondantes. ³² En outre, la détermination de l' activité de glycosyltransférase reste un important pratique et défi théorique parce que beaucoup de glycosyltransférases sont absents dans biofluides cliniques ou devenir inactif ex vivo. Malgré la difficulté de consistendétecter tly et la quantification des quantités ultra-minute de glycanes entiers uniques, les praticiens de la spectrométrie de masse ont fait d'énormes progrès vers l'emploi glycanes intactes comme marqueurs cliniques. Nous avons récemment développé une approche complémentaire à l'analyse des glycanes intactes, utilisant GC-MS, facilite la détection de toutes les branches point constituant et monosaccharides spécifiques liaison ( "noeuds glycanes") qui confèrent ainsi un caractère unique à chaque glycane et dans de nombreux cas servent directement substituts moléculaires qui permettent de quantifier l'activité relative de la glycosyltransférase (s) coupable.

Depuis sa première rapporté application directe à l' analyse glycanes en 1958, chromatographie en phase gazeuse (GC) a prouvé une technique puissante pour analyser les mono- et disaccharides per-méthylé, ³⁴ déterminer leur anomericity et la configuration absolue, et de les séparer pour analyse ultérieure par spectrométrie de masse. ³⁵ Entre 1984 et 2007, Ciucanu et ses collèguesintroduit et affiné une technique de perméthylation glycane phase solide qui employait l' hydroxyde de sodium et de l' iodométhane, suivie d' une extraction liquide / liquide de glycanes perméthylés utilisant de l' eau et le chloroforme. ^35,36 Entre 2005 et 2008, Kang et ses collègues ont intégré une rotation de gain de temps approche -column dans l'étape de perméthylation. ^37,38 En 2008, le groupe de recherche Goetz a conçu une phase solide quantitative perméthylation méthode glycane-profilage par laser désorption-ionisation assistée par matrice (MALDI) spectrométrie de masse pour comparer et potentiellement distinguer invasive et non les cellules cancéreuses du sein -invasive; ³⁹ puis, en 2009, l'équipe Goetz combinée enzymatique et les techniques de libération chimiques clivent O -glycans de glycoprotéines intactes dans un schéma de perméthylation en phase solide fortement alcalin ⁴⁰ Bien que la procédure Goetz facilitée perméthylation simultanée et la libération de produits chimiques. de -glycans O, il a été appliqué uniquement aux pré-isolé glycoles protéines. Nous avons modifié cette technique en 2013 et adapté pour biofluides non fractionnées entiers et des échantillons de tissus homogénéisés en incorporant l' acide trifluoroacétique (TFA) hydrolyse, réduction et acétylation étapes. ³³ Ces étapes supplémentaires libérer également les glycanes de glycolipides et N lié en glycanes de glycoprotéines et convertir les en acétates partiellement méthylés d'alditols (PMAAs, figure 1), dont les modèles de méthylation et acétylation distinctive de faciliter l' analyse par GC-MS et uniquement caractériser les nœuds glycanes constitutifs dans l'original intact polymère glycane ⁴¹ (Figure 2). ³³ en fin de compte, ce procédure produit un portrait composite de tous les glycanes dans un fluide biologique complexe basé sur la quantification par rapport direct des caractéristiques uniques, telles que des glycanes "fucosylation du noyau", "6-sialylation", "GlcNAc bissecteur", et "bêta 1-6 ramification» – chaque dérivé d'un seul chromatograp GC-MSpic HIC. Cet article présente l'optimisation du perméthylation, acétylation, l'isolement et les étapes de nettoyage ainsi que des améliorations dans le mode de quantification relative.

Protocol

Attention: Éviter le contact / des yeux de la peau avec l' un des réactifs utilisés dans cette expérience. Lors de l'exposition, rincer soigneusement la zone touchée avec de l'eau et consulter immédiatement un médecin. 1. perméthylation et Glycan Extraction Préparation de la colonne Obtenir autant d'unités de colonne microcentrifugeuse de rotation que les échantillons à analyser. Pause et détacher les bouchons de …

Representative Results

Chromatogramme de courant ionique total (CIT) présentant perméthylation, de l' hydrolyse, la réduction et l' acétylation des échantillons de plasma sanguin humain par rapport au cas où les deux étapes critiques de la perméthylation ont été exécutées de manière incorrecte sont représentés sur la figure 3. Absolute Rendement HexNAcs relative à hexoses: <p class="jove_content"…

Discussion

En général, la production réussie d'acétates d' alditol partiellement méthylés de (PMAAs) à partir des hexoses se heurte à moins de difficultés et est plus robuste que la production réussie de N -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs. Le mécanisme exact de ce phénomène car il joue dans toutes les étapes de cette procédure est inconnue, mais doit se rapporter à la chimie unique du groupe acétyl N (plutôt que le groupe hydroxyle) qui est unique à HexNAcs par rapport à hexoses. Le m?…

Materials

Sodium hydroxide beads	367176	Sigma-Aldrich	20-40 mesh, reagent grade 97%
0.9 mL Spin column	69705	Pierce division of ThermoFisher Scientific	Includes  plugs and polyethylene frits
GC-MS autosampler vial (silanized)*	C4000-9	ThermoFisher Scientific	Target DP High Recovery Vial, 1.5 mL, 12 x 32 mm, Includes Teflon-lined pierceable caps
1.5 mL polypropylene test tubes	05-402-25	ThermoFisher Scientific	Snap-cap lid
2 mL polypropylene test tubes	05-408-138	ThermoFisher Scientific	Snap-cap lid
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	D8418	Sigma-Aldrich	BioReagent for molecular biology, reagent grade >99.0%
Iodomethane	I8507	Sigma-Aldrich	Contains copper as stabilizer, ReagentPlus 99%
Acetonitrile	A955-4	ThermoFisher Scientific	Optima LC/MS
Microcentrifuge	75002436: Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge	ThermoFisher Scientific	24 x 1.5/2.0 rotor with ClickSeal biocontainment lid. Rotor catalog number: 75003424
13 x 100 glass test tube (silanized)*	53283-800	VWR	13 x 100 mm borosilicate glass test tubes with screw-cap finish
Caps for glass test tubes	14-930-15D	ThermoFisher Scientific	Kimble™ Black Phenolic Screw Caps; 13mm-415 GPI thread; PTFE-faced rubber liner.
Sodium chloride	S7653	Sigma-Aldrich	>99.5% pure
Chloroform	4440-08	Macron Fine Chemicals
Trifluoroacetic acid	299537	Sigma-Aldrich	99% purified by redistillation for protein sequencing
Sodium borohydride	71321	Fluka Analytical	99%
Ammonium hydroxide solution	320145	Sigma-Aldrich	NH3 content: 28.0 – 30.0%
Methanol	AH230-4	Honeywell Burdick & Jackson	HPLC grade
Acetic acid	320099	Sigma-Aldrich	99.70%
Plastic vacuum desiccator	Any model of adequate size	FoodSaver
Acetic anhydride	539996	Sigma-Aldrich	99.50%
Dichloromethane	D143SK-4	ThermoFisher Scientific	Stabilized HPLC grade
Acetone	9006-03	J.T.Baker	Baker Analyzed
Heated evaporation manifold (main unit)	pi18823	ThermoFisher Scientific	Thermo Scientific* Reacti-Therm* Heating and Stirring Module; Triple-block Model with Heating and Stirring Function
Heated evaporation manifold (overhead evaporator)	pi18826	ThermoFisher Scientific	ThermoScientific* Reacti-Vap Evaporator, 27-port; For use with triple-block Reacti-Therm heating module
Aluminum sample-holder blocks for evaporation manifold	pi18816	ThermoFisher Scientific	Block, Aluminum, Reacti-Block S-1, Holds 13mm dia test tubes, 13 holes (14 dia. x 45mm deep)
Gas chromatograph	Model A7890	Agilent	Equipped with CTC PAL autosampler
Mass spectrometer	GCT Premier (Time-of-Flight)	Waters
Split-mode liner (deactivated / silanized)	5183-4647	Agilent	Containing a small plug of silanized glass wool
DB-5ms GC column	122-5532	Agilent	30 m x 0.25 mm ID x 0.25 micron film thickness
Chlorotrimethylsilane	95541	Sigma-Aldrich
Glass vacuum desiccator (for glassware silanization)	EW-06536-30	Cole-Parmer	12" wide; 230 mm plate size
*Glassware silanization is carried out in-house, overnight using chlorotrimethylsilane vapor in a large glass vacuum desiccator.