マウスの冠動脈内皮細胞の単離
Summary
This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.
Abstract
内皮細胞は、血管の内壁を裏打ちし、血管緊張、血管透過性、および新血管形成の調節に重要な役割を果たしています。内皮細胞の機能障害は、虚血性心疾患を含む多くの心血管疾患の発症および進行に関与しています。冠動脈内皮細胞の機能と特徴付けを調べるために、細胞の単離は、最初のステップであり、それはその後の実験を行うために、高純度と量を必要とします。このプロトコルは、成体マウス冠動脈内皮細胞を単離するための効率的な方法を説明します。マウスの心臓を切開し、小片に刻んだされます。ディスパーゼおよびコラゲナーゼIIを使用して、心臓の消化の後、細胞を洗浄し、抗CD31抗体に結合された磁気ビーズと共にインキュベートしました。内皮細胞とビーズを数回洗浄し、様々な用途で使用する準備ができている、イメージングおよび分子生物学的experime含めていますNTS。効率的な分離は、90％以上の純度で1心あたり約10 4個の細胞が得られます。
Introduction
様々な心血管疾患および代謝性疾患のマウスモデルは、患者に見られるものと類似している生理学的および分子的変化を負います。さらに、マウスの遺伝的変化は、私たちが疾患の発症と進行における特定の遺伝子の病原性の役割を調査することを可能にする強力なツールです。今日では、細胞型特異的遺伝子ノックインまたはチェックアウトマウスは簡単に多くの研究室で生成され、特定の細胞型におけるmRNAおよびタンパク質レベルの測定は、マウスは本当に遺伝的に変更されたかどうかを決定するための最初のステップであるされています。
内皮は、内皮細胞（EC）のラインの内側血管壁の薄い単層です。内皮細胞は、血管緊張、血管透過性、および新しい血管の形成1,2の調節に重要な役割を果たしています。内皮機能障害は、多くの病的状態および内皮機能の変化の顕著な特徴は、様々な車につながる可能性がありますdiovascular疾患3,4。生理学的および病態生理学的条件下での内皮細胞の機能を研究することが重要です。
電気部品5-8と分離法が使用される組織および種に応じて最適化する必要がある単離するためのいくつかの方法があります。異なる組織からのECは、それらの表面マーカーおよびタンパク質発現9に対して異質の高いレベルを表示するためです。内皮細胞の成功の分離は、しばしば挑戦することと訓練と実践のいくつかの学位を必要とすることができます。達成されると、このプロトコルで提案された単離方法は、安定的かつ効率的であることがわかります。
この方法の全体的な目標は、高品質と量のマウス冠状動脈のEC（MCECs）を得ることです。心臓から採取した細胞の量は、他の技術を用いて他の組織から採取した細胞よりも少ない場合でも、この技術はまだ賭けを提供しますターの品質。得られた集団における内皮細胞の純度は90％以上です。したがって、この技術は、細胞イメージングとして純粋に単離された内皮細胞に依存するアプリケーションのために理想的です。
Protocol
Representative Results
Discussion
研究において最も広く使用されている内皮細胞は、その利便性と培養の容易さのヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）です。しかし、多くの研究は、他の特定の臓器10からの内皮細胞の単離によって達成生理学的モデルの可用性を必要とします。内皮細胞は、心臓組織内の細胞の非常にマイナーな人口を構成しています。それらの単離および培養は非常に困難であることを証明することがで?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、国立衛生研究所（A.牧野へHL115578）からの助成金によってサポートされていました。
Materials
| BSA | Sigma | A3311-10G | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| HBSS | Fisher | SH3026801 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| Sheep anti-rat IgG beads | Life Technologies | F-410L | DynaBeads pan mouse IgG , Thermo Fisher Scientific, cat# 11035 |
| Rat anti-mouse PECAM Antibody | BD Pharmigen | 550274 | BD Biosciences |
| IFCS | Fisher | SH30072.04 | |
| M199 | Fisher | MT10060-CV | |
| Dispase (Neutral Protease) | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS02109 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS004176 | |
| Glycerol | Fisher | BP381-1 | |
| Igepal | Sigma | 13021-50ml | I3021-50 ml |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma | P0044-1ml | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-1 ml | |
| Heparin | Sigma | H3149-100KU | |
| FBS | Fisher/Mediatech | MT35010CV | |
| D-Valine | Sigma | V1255-5G | |
| EGS | BD | 356006 | Corning |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher/Mediatech | MT-30-002-Cl | MT-30-002-CI |
References
- Michiels, C. Endothelial cell functions. J Cell Physiol. 196, 430-443 (2003).
- Sumpio, B. E., Riley, J. T., Dardik, A. Cells in focus: endothelial cell. Int J Biochem Cell Biol. 34, 1508-1512 (2002).
- Cines, D. B., et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood. 91, 3527-3561 (1998).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115, 1285-1295 (2007).
- Jin, Y., Liu, Y., Antonyak, M., Peng, X. Isolation and characterization of vascular endothelial cells from murine heart and lung. Methods Mol Biol. 843, 147-154 (2012).
- Makino, A., Platoshyn, O., Suarez, J., Yuan, J. X., Dillmann, W. H. Downregulation of connexin40 is associated with coronary endothelial cell dysfunction in streptozotocin-induced diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C221-C230 (2008).
- Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. Isolation of endothelial cells from murine tissue. J Immunol Methods. 244, 205-215 (2000).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat Protoc. 3, 1085-1091 (2008).
- Nolan, D. J., et al. Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration. Dev Cell. 26, 204-219 (2013).
- Sobczak, M., Dargatz, J., Chrzanowska-Wodnicka, M. Isolation and culture of pulmonary endothelial cells from neonatal mice. J Vis Exp. , (2010).
- Makino, A., Dai, A., Han, Y., Youssef, K. D., Wang, W., Donthamsetty, R., Scott, B. T., Wang, H., Dillmann, W. H. O-GlcNAcase overexpression reverses coronary endothelial cell dysfunction in type 1 diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 309, C593-C599 (2015).
- Sasaki, K., Donthamsetty, R., Heldak, M., Cho, Y., Scott, B. T., Makino, A. VDAC: old protein with new roles in diabetes. Am J Physiol Cell Physiol. 303, C1055-C1060 (2012).
