Выделение мыши ишемическая эндотелиальных клеток
Summary
This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.
Abstract
Эндотелиальные клетки выстилают внутреннюю стенку кровеносных сосудов и играют важную роль в регуляции сосудистого тонуса, проницаемости сосудов и новой сосудистой формации. Эндотелиальной дисфункции клеток вовлечена в развитие и прогрессирование многих сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе ишемической болезни сердца. Для изучения функции и характеристики коронарных эндотелиальных клеток, клеток изоляции является первым шагом, и это требует высокой степени чистоты и количества для проведения последующих экспериментов. Этот протокол описывает эффективный метод, чтобы изолировать взрослых мышей коронарные эндотелиальные клетки. Сердце мыши рассекают и измельчали на мелкие кусочки. После того, как переваривание сердца с помощью диспазу и коллагеназы II, клетки промывали и инкубировали с магнитными шариками, которые сопрягаются с анти-CD31 антителом. Шарики с эндотелиальные клетки промывают несколько раз и готовы к использованию в различных приложениях, в том числе изображений и молекулярно-биологической experimeNTS. Эффективная изоляция дает приблизительно 10 4 клеток на одно сердце с чистотой более 90%.
Introduction
Мышиные модели различных сердечно-сосудистых заболеваний и нарушений обмена веществ несут физиологические и молекулярные изменения, которые аналогичны тем, которые встречаются у пациентов. Кроме того, генетическое изменение мышей является мощным инструментом, который позволяет исследовать патогенную роль специфических генов в развитии и прогрессировании заболеваний. В настоящее время, ген-забивные камерного типа специфических или отъезда мышей легко образуются во многих лабораториях и измерения мРНК и уровня белка в определенных типах клеток является первым шагом в определении того, мыши были действительно генетически модифицированы.
Эндотелий представляет собой тонкий один слой эндотелиальных клеток (ЭКС), что линии внутренней стенки сосуда. Эндотелиальные клетки играют важную роль в регуляции сосудистого тонуса, проницаемости сосудов, а также новые сосудистые образования 1,2. Эндотелиальная дисфункция является отличительной чертой многих патологических состояний и изменений в эндотелиальной функции может привести к различным автомобилясосудистых заболеваний 3,4. Таким образом, существенным для изучения функции эндотелиальных клеток в физиологических и патофизиологических условиях.
Есть несколько способов , чтобы изолировать ECs 5-8 и метод изоляции должен быть оптимизирован в зависимости от того, который будет использоваться тканей и видов. Это происходит потому , что КЭ из разных тканей показывают высокий уровень неоднородности по отношению к их поверхности маркеров и экспрессии белка 9. Успешное выделение эндотелиальных клеток часто может быть сложным и требует некоторой степени обучения и практики. После того, как достигнуто, способ выделения предложенного в данном протоколе оказывается стабильной и эффективной.
Общая цель этого метода является получение мыши коронарных (MCECs ECs) высокого качества и количества. Даже при том, что количество клеток, выделенных из сердца меньше, чем клетки, собранные из других тканей с использованием других методов, этот метод все еще обеспечивает ставкуКачество тер. Чистота эндотелиальных клеток в результате популяции превышает 90%. Таким образом, этот метод был бы идеальным для приложений, которые опираются на чисто изолированных эндотелиальных клетках, таких как клетки визуализации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее широко используемые эндотелиальные клетки в исследовании являются эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVECs) из-за их удобства и простоты культивирования. Тем не менее, много исследований требует наличия физиологической модели достигается за счет выделения эндотел?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом Национального института здоровья (HL115578 А. Макино).
Materials
| BSA | Sigma | A3311-10G | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| HBSS | Fisher | SH3026801 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| Sheep anti-rat IgG beads | Life Technologies | F-410L | DynaBeads pan mouse IgG , Thermo Fisher Scientific, cat# 11035 |
| Rat anti-mouse PECAM Antibody | BD Pharmigen | 550274 | BD Biosciences |
| IFCS | Fisher | SH30072.04 | |
| M199 | Fisher | MT10060-CV | |
| Dispase (Neutral Protease) | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS02109 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS004176 | |
| Glycerol | Fisher | BP381-1 | |
| Igepal | Sigma | 13021-50ml | I3021-50 ml |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma | P0044-1ml | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-1 ml | |
| Heparin | Sigma | H3149-100KU | |
| FBS | Fisher/Mediatech | MT35010CV | |
| D-Valine | Sigma | V1255-5G | |
| EGS | BD | 356006 | Corning |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher/Mediatech | MT-30-002-Cl | MT-30-002-CI |
References
- Michiels, C. Endothelial cell functions. J Cell Physiol. 196, 430-443 (2003).
- Sumpio, B. E., Riley, J. T., Dardik, A. Cells in focus: endothelial cell. Int J Biochem Cell Biol. 34, 1508-1512 (2002).
- Cines, D. B., et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood. 91, 3527-3561 (1998).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115, 1285-1295 (2007).
- Jin, Y., Liu, Y., Antonyak, M., Peng, X. Isolation and characterization of vascular endothelial cells from murine heart and lung. Methods Mol Biol. 843, 147-154 (2012).
- Makino, A., Platoshyn, O., Suarez, J., Yuan, J. X., Dillmann, W. H. Downregulation of connexin40 is associated with coronary endothelial cell dysfunction in streptozotocin-induced diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C221-C230 (2008).
- Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. Isolation of endothelial cells from murine tissue. J Immunol Methods. 244, 205-215 (2000).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat Protoc. 3, 1085-1091 (2008).
- Nolan, D. J., et al. Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration. Dev Cell. 26, 204-219 (2013).
- Sobczak, M., Dargatz, J., Chrzanowska-Wodnicka, M. Isolation and culture of pulmonary endothelial cells from neonatal mice. J Vis Exp. , (2010).
- Makino, A., Dai, A., Han, Y., Youssef, K. D., Wang, W., Donthamsetty, R., Scott, B. T., Wang, H., Dillmann, W. H. O-GlcNAcase overexpression reverses coronary endothelial cell dysfunction in type 1 diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 309, C593-C599 (2015).
- Sasaki, K., Donthamsetty, R., Heldak, M., Cho, Y., Scott, B. T., Makino, A. VDAC: old protein with new roles in diabetes. Am J Physiol Cell Physiol. 303, C1055-C1060 (2012).
