Synthèse de la longueur d'onde de décalage d'ADN à l'aide de sondes d'hybridation cyanine photostable
Summary
Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.
Abstract
Dans ce protocole, nous démontrons une méthode pour la synthèse de 2'-alcyne modifié acide désoxyribonucléique (ADN) brins par synthèse en phase solide automatisée en utilisant la chimie phosphoramidite standard. Les oligonucléotides sont post-synthétiquement marqués par deux nouveaux colorants de cyanine photostable en utilisant le cuivre catalysée par un clic-chimie. La synthèse du donneur et accepteur de colorant est décrit et est réalisée en trois étapes consécutives. Avec l'ADN que l'architecture environnante, ces deux colorants sont soumis à un transfert d'énergie quand ils sont amenés en étroite proximité par hybridation. Par conséquent, le recuit des deux brins d'ADN simple brin est visualisée par un changement de couleur de la fluorescence. Ce changement de couleur est caractérisé par spectroscopie de fluorescence, mais peut aussi être directement observée à l'aide d'un rayonnement ultraviolet de poche (UV), la lampe. Le concept d'une double lecture de la couleur de fluorescence rend ces sondes d'oligonucléotides d'excellents outils pour l'imagerie moléculaire en particulier lorsque le pho décrittostable colorants sont utilisés. De ce fait, le photoblanchiment des sondes d'imagerie est empêchée, et les processus biologiques peuvent être observées en temps réel pendant une période de temps plus longue.
Introduction
L' imagerie moléculaire représente une technique fondamentale pour la compréhension des processus biologiques dans les cellules vivantes. 1-3 Le développement de sondes fluorescentes d'acides nucléiques sur la base de ces applications chimiques et biologiques est devenu un domaine de recherche en pleine expansion. Ces sondes fluorescentes doivent répondre à quelques exigences pour devenir des outils appropriés pour l'imagerie cellulaire. Tout d' abord, les colorants appliqués doivent présenter une fluorescence avec des rendements quantiques élevés, les changements de grande Stokes et, surtout, de hauts photostabilities pour permettre à long terme dans l' imagerie in vivo. Et deuxièmement, ils doivent montrer une lecture de fluorescence fiable. Conventionnel chromophore-quencher-systèmes sont basés sur la lecture d'une seule couleur de fluorescence par de simples changements dans l' intensité de fluorescence. 4 Cette approche porte le risque de résultats faussement positifs ou faussement négatifs en raison de l' autofluorescence des composants intracellulaires ou faibles rapports signal sur bruit en raison de l'extinction indésirable par d'autres composants. 4
Nous avons récemment rapporté sur le concept de "feux d'ADN" qui montrent deux lectures de couleurs de fluorescence en utilisant deux chromophores différents. 5-6 Le concept est basé sur le transfert d'énergie (ET) à partir du donneur de colorant au colorant accepteur qui modifie la fluorescence couleur (voir Figure 1). Ceci permet une lecture plus fiable et fournit ainsi un outil puissant pour les sondes d'imagerie fluorescentes. L'étiquetage des oligonucléotides avec des colorants fluorescents peut être réalisée par deux méthodes différentes. Des colorants peuvent être incorporés lors de la synthèse chimique d'ADN sur une phase solide en utilisant des blocs de construction des phosphoramidites modifiés en conséquence. 7 Cette méthode est limitée aux colorants qui sont stables dans des conditions de phosphoramidite et de déprotection standard. En variante, les méthodes de modification post-synthèse ont été établies dans la chimie des oligonucléotides. Ici, nous démontrons la synthèse d'un de nos nouvelles photosl' énergie de table paires de transfert 8,9 et l'étiquetage post-synthétique de l' ADN en utilisant le cuivre catalysée 1,3-cycloaddition entre azides et alcynes (CuAAC). 10
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole montre la procédure complète pour marquer l'ADN post-synthétiquement via CuAAC par des colorants fluorescents azoture modifié. Cela comprend la synthèse des colorants et de l'ADN modifié par alcyne ainsi que la procédure d'étiquetage.
La synthèse des colorants en quatre étapes. Tous les produits peuvent être obtenus par une précipitation assez simple en raison de leur charge positive et pas de temps Chromatographie sur colonne est nécessaire. L'intro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le soutien financier de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Wa 1386 / 17-1), la formation à la recherche Groupe GRK 2039 (financé par DFG) et KIT est grandement apprécié.
Materials
| synthesis | |||
| 4-Picoline | Sigma Aldrich | 239615 | |
| 1,3-Diiodopropane | Sigma Aldrich | 238414 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 10660131 | HPLC grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10456870 | technical grade |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | p.a. grade |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | 10626642 | technical grade |
| Indole-3-carboxaldehyde; 98% | ABCR | AB112969 | |
| Potassium carbonate, 99+% | Acros | 424081000 | |
| dimethylcarbonate | Sigma Aldrich | 517127 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve | Acros | 348435000 | |
| Sodium sulfate | Bernd Kraft | 12623.46 | |
| Ethanol, 99.5% | Acros | 397690010 | |
| Piperidine, 99% | Acros | 147181000 | |
| Diethylether | Fisher Scientific | 10407830 | technical grade |
| 2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97% | ABCR | AB125050 | |
| 4-Methylquinoline | ABCR | AB117222 | |
| DNA synthesis | |||
| Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer | Applied Biosystems | - | |
| DMT-dA(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | A111081 | |
| DMT-dT Phosphoramidite | Sigma Aldrich | T111081 | |
| DMT-dG(dmf) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | G11508 | |
| DMT-dC(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | C11108 | |
| Amidite Diluent for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010010 | |
| Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010400 | |
| Cap A | Sigma Aldrich | L840000 | |
| Cap B | Sigma Aldrich | L850000 | |
| CPG dT Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | T461010 | |
| CPG dA(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | A461010 | |
| CPG dG(ib) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | G461010 | |
| CPG dC(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | C461010 | |
| ammonia (aqueous solution) | Fluka Analytical | 318612 | |
| centrifugal devices nanosep 0.45 µm | Pall | ODGHPC34 | |
| 5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator) | Sigma Aldrich | 75666 | |
| 2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite | Chem Genes | ANP-7754 | |
| workup | |||
| vacuum concentrator | Christ | ||
| clicking procedure | |||
| Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate | Sigma Aldrich | 346276 | |
| Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| EDTA disodium salt | Sigma Aldrich | E5134 | |
| TBTA-ligand | - | - | synthesized according to a literature procedure [1] |
| HPLC | |||
| HPLC-system | Shimadzu | ||
| MALDI-Biflex-IV spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| LC-318 C18 column | Supelcosil via Sigma Aldrich | 58368 | |
| determination of concentration | |||
| ND 1000 Spectrophotometer | nanodrop | ||
| sample preparation and spectroscopy | |||
| Cary 100 Bio | Varian | ||
| Fluoromax-3 fluorimeter | Jobin-Yvon | ||
| [1] R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855. |
References
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