Synthese von Wavelength-Verschiebung DNA Hybridisierungssonden durch Verwendung von Photostabile Cyaninfarbstoffe
Summary
Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.
Abstract
In diesem Protokoll zeigen wir ein Verfahren für die Synthese von 2'-Alkin-Desoxyribonukleinsäure (DNA) Stränge durch automatisierte Festphasensynthese unter Verwendung von Standard-Phosphoramidit-Chemie modifiziert. Oligonukleotide werden nach der Synthese durch zwei neue photo Cyaninfarbstoffen markiert unter Verwendung von Kupfer-katalysierte Klick-Chemie. Die Synthese von Spender und Akzeptor-Farbstoff ist, beschrieben und wird in drei aufeinanderfolgenden Schritten durchgeführt. Mit der DNA wie die umgebende Architektur, diese beiden Farbstoffe laufen einen Energietransfer, wenn sie in die Nähe von Hybridisierung gebracht werden. Daher Annealing von zwei einzelsträngigen DNA-Stränge wird durch eine Veränderung der Fluoreszenzfarbe visualisiert. Diese Farbänderung wird durch Fluoreszenz-Spektroskopie charakterisiert, sondern auch durch die Verwendung eines Hand ultraviolette (UV) Lampe direkt beobachtet werden kann. Das Konzept einer Doppelfluoreszenzfarbe Auslese macht diese Oligonukleotidsonden hervorragende Werkzeuge für die molekulare Bildgebung vor allem, wenn die beschriebene photostable Farbstoffe verwendet. Dadurch Photobleaching der Abbildungssonden verhindert und biologische Prozesse in Echtzeit für einen längeren Zeitraum beobachtet werden.
Introduction
Die molekulare Bildgebung stellt eine grundlegende Technik für die in lebenden Zellen biologischen Prozesse verstehen. 1-3 Die Entwicklung von fluoreszierenden Nukleinsäure-basierte Sonden für solche chemisch-biologische Anwendungen ein expandierendes Forschungsgebiet geworden ist. Diese Fluoreszenzsonden müssen einige Anforderungen erfüllen die geeigneten Werkzeuge für Cell Imaging zu werden. Erstens sollten die eingesetzten Farbstoffe Fluoreszenz mit hoher Quantenausbeute aufweisen, große Stokes-Verschiebungen und, was am wichtigsten ist , hohe Photostabilitäten Langzeit – in vivo – Bildgebung zu ermöglichen. Und zweitens sollten sie eine zuverlässige Fluoreszenzanzeige zeigen. Herkömmliche Chromophor-Löscher-Systeme auf der Anzeige eines einzelnen Fluoreszenzfarbe durch einfache Veränderungen in der Fluoreszenzintensitäten basieren. 4 Dieser Ansatz das Risiko von falsch – positiven oder falsch – negative Ergebnisse trägt wegen Autofluoreszenz von intrazellulären Komponenten oder Low – Signal-zu-Rausch – Verhältnis aufgrund unerwünschter Löschung durch andere componenten. 4
Vor kurzem berichteten wir über das Konzept der "DNA – Ampel" , die zwei unterschiedliche Chromophore durch Verwendung von Dual – Fluoreszenzfarbe Ablesungen zeigen. 5-6 Das Konzept basiert auf dem Energietransfer (ET) aus dem Donor – Farbstoff an den Akzeptor – Farbstoff, der die Fluoreszenz ändert Farbe (siehe Abbildung 1). Dies ermöglicht eine zuverlässigere Anzeige und stellt damit ein leistungsfähiges Werkzeug für Fluoreszenz-Imaging-Sonden. Markierung von Oligonucleotiden mit Fluoreszenzfarbstoffen kann durch zwei verschiedene Ansätze erreicht werden. Farbstoffe können während der chemischen DNA – Synthese an einer festen Phase unter Verwendung von entsprechend modifizierten Phosphoramidit – Bausteinen. 7 Diese Methode ist beschränkt auf Farbstoffe eingearbeitet werden , die unter Bedingungen Standard – Phosphoramidit und Entschützung stabil sind. Als Alternative wurden post-synthetische Modifikation Methoden in Oligonukleotidchemie etabliert. Hier zeigen wir die Synthese eines unserer neuen FotosTabelle Energietransferpaare 8,9 und die post-synthetischen Markierung von DNA durch Kupfer-katalysierte 1,3-Cyclo zwischen Aziden und Alkinen (CuAAC) verwendet wird . 10
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll zeigt die komplette Prozedur DNA post-synthetisch über CuAAC durch Azid-modifizierte fluoreszierende Farbstoffe zu kennzeichnen. Dies schließt die Synthese der Farbstoffe und Alkin-modifizierte DNA als auch die Markierungsverfahren.
Die Synthese der Farbstoffe folgende vier Schritte. Alle Produkte können durch eine recht einfache Fällung erhalten werden aufgrund ihrer positiven Ladung und nicht zeitaufwendig Säulenchromatographie benötigt. Die Einführung der Azid-Funk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die finanzielle Unterstützung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Wa 1386 / 17-1), das Graduiertenkolleg GRK 2039 (gefördert von der DFG) und KIT gedankt.
Materials
| synthesis | |||
| 4-Picoline | Sigma Aldrich | 239615 | |
| 1,3-Diiodopropane | Sigma Aldrich | 238414 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 10660131 | HPLC grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10456870 | technical grade |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | p.a. grade |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | 10626642 | technical grade |
| Indole-3-carboxaldehyde; 98% | ABCR | AB112969 | |
| Potassium carbonate, 99+% | Acros | 424081000 | |
| dimethylcarbonate | Sigma Aldrich | 517127 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve | Acros | 348435000 | |
| Sodium sulfate | Bernd Kraft | 12623.46 | |
| Ethanol, 99.5% | Acros | 397690010 | |
| Piperidine, 99% | Acros | 147181000 | |
| Diethylether | Fisher Scientific | 10407830 | technical grade |
| 2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97% | ABCR | AB125050 | |
| 4-Methylquinoline | ABCR | AB117222 | |
| DNA synthesis | |||
| Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer | Applied Biosystems | - | |
| DMT-dA(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | A111081 | |
| DMT-dT Phosphoramidite | Sigma Aldrich | T111081 | |
| DMT-dG(dmf) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | G11508 | |
| DMT-dC(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | C11108 | |
| Amidite Diluent for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010010 | |
| Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010400 | |
| Cap A | Sigma Aldrich | L840000 | |
| Cap B | Sigma Aldrich | L850000 | |
| CPG dT Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | T461010 | |
| CPG dA(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | A461010 | |
| CPG dG(ib) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | G461010 | |
| CPG dC(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | C461010 | |
| ammonia (aqueous solution) | Fluka Analytical | 318612 | |
| centrifugal devices nanosep 0.45 µm | Pall | ODGHPC34 | |
| 5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator) | Sigma Aldrich | 75666 | |
| 2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite | Chem Genes | ANP-7754 | |
| workup | |||
| vacuum concentrator | Christ | ||
| clicking procedure | |||
| Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate | Sigma Aldrich | 346276 | |
| Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| EDTA disodium salt | Sigma Aldrich | E5134 | |
| TBTA-ligand | - | - | synthesized according to a literature procedure [1] |
| HPLC | |||
| HPLC-system | Shimadzu | ||
| MALDI-Biflex-IV spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| LC-318 C18 column | Supelcosil via Sigma Aldrich | 58368 | |
| determination of concentration | |||
| ND 1000 Spectrophotometer | nanodrop | ||
| sample preparation and spectroscopy | |||
| Cary 100 Bio | Varian | ||
| Fluoromax-3 fluorimeter | Jobin-Yvon | ||
| [1] R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855. |
References
- Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging. Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).
- Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging. Chem. Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).
- Lee, J. S., Vendrell, M., Chang, Y. T. Diversity-oriented optical imaging probe development. Curr. Opin. Chem. Biol. 15 (6), 760-767 (2011).
- Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat. Biotechnol. 16 (1), 49-53 (1998).
- Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. #34;DNA Traffic Lights": Concept of Wavelength-Shifting DNA Probes and Application in an Aptasensor. ChemBioChem. 13 (8), 1136-1138 (2012).
- Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. DNA and RNA "Traffic Lights": Synthetic Wavelength-Shifting Fluorescent Probes Based on Nucleic Acid Base Substitutes for Molecular Imaging. J. Org. Chem. 78 (15), 7373-7379 (2013).
- Berndl, S., Wagenknecht, H. A. Fluorescent Color Readout of DNA Hybridization with Thiazole Orange as an Artificial DNA Base. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (13), 2418-2421 (2009).
- Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Synthesis of a Photostable Energy-Transfer Pair for "DNA Traffic Lights". Eur. J. Org. Chem. 34, 7547-7551 (2014).
- Walter, H. K., Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Development of a Wavelength-Shifting Fluorescent Module for the Adenosine Aptamer Using Photostable Cyanine Dyes. ChemistryOpen. 4 (2), 92-96 (2015).
- Gierlich, J., Burley, G. A., Gramlicj, P. M. E., Hammond, D. M., Carell, T. Click chemistry as a reliable method for the high-density postsynthetic functionalization of alkyne-modified DNA. Org. Lett. 8 (17), 3639-3642 (2006).
- Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. Synthesis of deoxyoligonucleotides on a polymer support. J. Am. Chem. Soc. 103 (11), 3185-3191 (1981).
- Fasman, G. D. . Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Volume 1: Nucleic Acids. , 589 (1975).
- Puglisi, J. D., Tinoco, J. I. Absorbance melting curves of RNA. Meth. Enzymol. 180, 304-325 (1989).
- Johansson, M. K., Fidder, H., Dick, D., Cook, R. M. Intramolecular Dimers: A New Strategy to Fluorescence Quenching in Dual-Labeled Oligonucleotide Probes. J. Am. Chem. Soc. 124, 6950-6956 (2002).
- Barrois, S., Wörner, S., Wagenknecht, H. A. The Role of Duplex Stability for Wavelength-Shifting Fluorescent DNA Probes: Energy Transfer vs Excition Interactions in DNA "Traffic Lights", Photochem. Photobiol. Sci. 13, 1126-1129 (2014).
