Sintesi della lunghezza d'onda-shifting DNA sonde di ibridazione utilizzando Fotostabile Cyanine Coloranti
Summary
Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.
Abstract
In questo protocollo, dimostriamo un metodo per la sintesi di 2'-alchino modificato acido (DNA) trefoli nucleici di sintesi in fase solida utilizzando la chimica automatizzata fosforamidite standard. Oligonucleotidi sono post-sinteticamente etichettate da due nuove tinte cianina fotostabili utilizzando rame-catalizzata click-chimica. La sintesi di dye donatore e accettore è descritto ed avviene in tre fasi consecutive. Con il DNA come l'architettura circostante, questi due coloranti subiscono un trasferimento di energia quando vengono portati in stretta prossimità mediante ibridazione. Pertanto, ricottura di due singoli filamenti di DNA bloccati viene visualizzato da un cambiamento di colore di fluorescenza. Questo cambiamento di colore è caratterizzato mediante spettroscopia di fluorescenza, ma può anche essere osservato direttamente utilizzando una lampada ultravioletta palmare (UV). Il concetto di una doppia lettura di fluorescenza di colore rende questi sonde oligonucleotidiche ottimi strumenti per l'imaging molecolare soprattutto quando il pho descrittocoloranti tostable vengono utilizzati. In tal modo, photobleaching delle sonde di imaging è impedito, e processi biologici può essere osservato in tempo reale per un periodo di tempo più lungo.
Introduction
Imaging molecolare rappresenta una tecnica fondamentale per la comprensione dei processi biologici all'interno delle cellule viventi. 1-3 Lo sviluppo di fluorescenti sonde base di acido nucleico per tali applicazioni chimico-biologico è diventato un campo di ricerca in espansione. Queste sonde fluorescenti devono soddisfare alcuni requisiti per diventare strumenti adatti per l'imaging cellulare. In primo luogo, i coloranti applicati devono mostrare fluorescenza con elevati rendimenti quantici, turni grande Stokes 'e, soprattutto, di alta photostabilities per consentire a lungo termine imaging in vivo. E in secondo luogo, essi dovrebbero mostrare una lettura di fluorescenza affidabile. Convenzionale cromoforo-quencher sistemi si basano sulla lettura di un singolo colore di fluorescenza con semplici cambiamenti di intensità di fluorescenza. 4 Questo approccio si assume il rischio di risultati falsi positivi o falsi negativi a causa di autofluorescenza di componenti intracellulari o bassi rapporti segnale-rumore a causa di quenching indesiderato da altri comcomponenti. 4
Recentemente abbiamo riportato sul concetto di "semafori DNA" che mostrano doppio letture colore fluorescenza utilizzando due cromofori differenti. 5-6 Il concetto è basato sul trasferimento di energia (ET) dalla tintura donatore al colorante accettore che cambia la fluorescenza colore (vedi Figura 1). Questo consente una lettura più affidabile e quindi fornisce un potente strumento per sonde di imaging fluorescenti. Etichettatura di oligonucleotidi con coloranti fluorescenti può essere ottenuto mediante due approcci diversi. Coloranti possono essere incorporati durante la sintesi del DNA chimica su una fase solida utilizzando blocchi fosforammidito corrispondentemente modificati. 7 Questo metodo è limitato ai coloranti che sono stabili in condizioni Phosphoramidite e deprotezione standard. In alternativa, le metodologie di modificazione post-sintetici sono stati stabiliti in oligonucleotide chimica. Qui, dimostriamo la sintesi di una delle nostre nuove fotoenergia tabella coppie di trasferimento 8,9 e l'etichettatura di post-sintetico del DNA utilizzando rame-catalizzata 1,3-cicloaddizione tra azidi ed alchini (CuAAC). 10
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo mostra la procedura completa di etichettare DNA post-sinteticamente tramite CuAAC dai coloranti fluorescenti azide modificati. Questo include la sintesi dei coloranti e il DNA alchino modificato così come la procedura di etichettatura.
La sintesi dei coloranti segue quattro fasi. Tutti i prodotti possono essere ottenuti da un piuttosto semplice precipitazione causa della loro carica positiva e non è necessaria tempo cromatografia su colonna. L'introduzione delle funzi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il sostegno finanziario dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Wa 1386 / 17-1), la ricerca di formazione Gruppo GRK 2039 (finanziato dalla DFG) e kit ringraziano.
Materials
| synthesis | |||
| 4-Picoline | Sigma Aldrich | 239615 | |
| 1,3-Diiodopropane | Sigma Aldrich | 238414 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 10660131 | HPLC grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10456870 | technical grade |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | p.a. grade |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | 10626642 | technical grade |
| Indole-3-carboxaldehyde; 98% | ABCR | AB112969 | |
| Potassium carbonate, 99+% | Acros | 424081000 | |
| dimethylcarbonate | Sigma Aldrich | 517127 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve | Acros | 348435000 | |
| Sodium sulfate | Bernd Kraft | 12623.46 | |
| Ethanol, 99.5% | Acros | 397690010 | |
| Piperidine, 99% | Acros | 147181000 | |
| Diethylether | Fisher Scientific | 10407830 | technical grade |
| 2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97% | ABCR | AB125050 | |
| 4-Methylquinoline | ABCR | AB117222 | |
| DNA synthesis | |||
| Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer | Applied Biosystems | - | |
| DMT-dA(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | A111081 | |
| DMT-dT Phosphoramidite | Sigma Aldrich | T111081 | |
| DMT-dG(dmf) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | G11508 | |
| DMT-dC(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | C11108 | |
| Amidite Diluent for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010010 | |
| Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010400 | |
| Cap A | Sigma Aldrich | L840000 | |
| Cap B | Sigma Aldrich | L850000 | |
| CPG dT Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | T461010 | |
| CPG dA(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | A461010 | |
| CPG dG(ib) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | G461010 | |
| CPG dC(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | C461010 | |
| ammonia (aqueous solution) | Fluka Analytical | 318612 | |
| centrifugal devices nanosep 0.45 µm | Pall | ODGHPC34 | |
| 5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator) | Sigma Aldrich | 75666 | |
| 2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite | Chem Genes | ANP-7754 | |
| workup | |||
| vacuum concentrator | Christ | ||
| clicking procedure | |||
| Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate | Sigma Aldrich | 346276 | |
| Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| EDTA disodium salt | Sigma Aldrich | E5134 | |
| TBTA-ligand | - | - | synthesized according to a literature procedure [1] |
| HPLC | |||
| HPLC-system | Shimadzu | ||
| MALDI-Biflex-IV spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| LC-318 C18 column | Supelcosil via Sigma Aldrich | 58368 | |
| determination of concentration | |||
| ND 1000 Spectrophotometer | nanodrop | ||
| sample preparation and spectroscopy | |||
| Cary 100 Bio | Varian | ||
| Fluoromax-3 fluorimeter | Jobin-Yvon | ||
| [1] R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855. |
References
- Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging. Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).
- Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging. Chem. Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).
- Lee, J. S., Vendrell, M., Chang, Y. T. Diversity-oriented optical imaging probe development. Curr. Opin. Chem. Biol. 15 (6), 760-767 (2011).
- Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat. Biotechnol. 16 (1), 49-53 (1998).
- Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. #34;DNA Traffic Lights": Concept of Wavelength-Shifting DNA Probes and Application in an Aptasensor. ChemBioChem. 13 (8), 1136-1138 (2012).
- Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. DNA and RNA "Traffic Lights": Synthetic Wavelength-Shifting Fluorescent Probes Based on Nucleic Acid Base Substitutes for Molecular Imaging. J. Org. Chem. 78 (15), 7373-7379 (2013).
- Berndl, S., Wagenknecht, H. A. Fluorescent Color Readout of DNA Hybridization with Thiazole Orange as an Artificial DNA Base. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (13), 2418-2421 (2009).
- Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Synthesis of a Photostable Energy-Transfer Pair for "DNA Traffic Lights". Eur. J. Org. Chem. 34, 7547-7551 (2014).
- Walter, H. K., Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Development of a Wavelength-Shifting Fluorescent Module for the Adenosine Aptamer Using Photostable Cyanine Dyes. ChemistryOpen. 4 (2), 92-96 (2015).
- Gierlich, J., Burley, G. A., Gramlicj, P. M. E., Hammond, D. M., Carell, T. Click chemistry as a reliable method for the high-density postsynthetic functionalization of alkyne-modified DNA. Org. Lett. 8 (17), 3639-3642 (2006).
- Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. Synthesis of deoxyoligonucleotides on a polymer support. J. Am. Chem. Soc. 103 (11), 3185-3191 (1981).
- Fasman, G. D. . Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Volume 1: Nucleic Acids. , 589 (1975).
- Puglisi, J. D., Tinoco, J. I. Absorbance melting curves of RNA. Meth. Enzymol. 180, 304-325 (1989).
- Johansson, M. K., Fidder, H., Dick, D., Cook, R. M. Intramolecular Dimers: A New Strategy to Fluorescence Quenching in Dual-Labeled Oligonucleotide Probes. J. Am. Chem. Soc. 124, 6950-6956 (2002).
- Barrois, S., Wörner, S., Wagenknecht, H. A. The Role of Duplex Stability for Wavelength-Shifting Fluorescent DNA Probes: Energy Transfer vs Excition Interactions in DNA "Traffic Lights", Photochem. Photobiol. Sci. 13, 1126-1129 (2014).
