光安定シアニン色素を用いた波長シフトDNAハイブリダイゼーションプローブの合成
Summary
Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.
Abstract
このプロトコルでは、我々は、2'-アルキンの合成のための方法を示す標準的なホスホルアミダイト化学を用いて自動化固相合成によってデオキシリボ核酸（DNA）鎖を修飾。オリゴヌクレオチドは合成後の銅触媒によるクリックケミストリーを使用して、2つの新しい光安定シアニン色素によって標識されています。両方のドナーとアクセプター色素の合成が記載されており、三つの連続工程で行われます。それらはハイブリダイゼーションにより近接させられるときに、周囲のアーキテクチャとしてDNAと、これら2つの色素が、エネルギー移動を受けます。したがって、2つの一本鎖DNA鎖のアニーリングは、蛍光色の変化によって視覚化されます。この色の変化は、蛍光分光法によって特徴付けられるだけでなく、直接ハンドヘルド紫外線（UV）ランプを使用して観察することができます。デュアル蛍光色読み出しの概念は、これらのオリゴヌクレオチドプローブを分子イメージング特に記載フォーのための優れたツールを作りますtostable染料が使用されています。これにより、イメージングプローブの光退色を防止し、かつ生物学的プロセスは、より長い期間のために実時間で観察することができます。
Introduction
分子イメージングは、生きた細胞内の生物学的プロセスを理解するための基本的な技術を表している。1-3、化学、生物学的応用のための蛍光核酸ベースのプローブの開発が拡大する研究分野となっています。これらの蛍光プローブは、細胞イメージングのために適したツールとなるために、いくつかの要件を満たす必要があります。まず、適用される染料は、in vivoイメージングに長期を可能にするために、高い量子収率、大きなストークスシフトと、最も重要なのは、高いphotostabilitiesで蛍光を示すべきです。そして第二に、彼らは信頼性の高い蛍光読み出しを示すべきです。従来の発色団-消光剤、システムは、蛍光強度の簡単な変更によって、単一の蛍光色の読み出しに基づいている。4このアプローチは、細胞内の成分の自己蛍光または低い信号対雑音比に起因する偽陽性または偽陰性結果のリスクを負います他のCOMによって望ましくない消光によるものンポーネント。4
我々は最近、二つの異なる発色団を使用して二重蛍光色の読み出しを示す「DNAの交通信号灯」の概念に報告した。5-6概念は蛍光を変更するアクセプター色素にドナー色素からのエネルギー移動（ET）に基づいています色（ 図1参照）。これは、より信頼性の高い読み出しを可能にし、それによって蛍光イメージングプローブのための強力なツールを提供します。蛍光色素を有するオリゴヌクレオチドの標識には、2つの異なるアプローチによって達成することができます。染料は、それに応じて修正されたホスホルアミダイトビルディングブロックを使用して、固相に化学的DNA合成の間に組み込むことができる。7、この方法は、標準的なホスホルアミダイトおよび脱保護条件下で安定であり、色素に限定されます。別の方法として、合成後修飾方法は、オリゴヌクレオチドの化学的性質に設立されました。ここでは、私たちの新しい写真の1の合成を実証しますテーブルのエネルギー伝達対8,9とアジドとアルキン（CuAAC）間の銅触媒1,3-付加環を使用して、DNAの合成後の標識。10
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、アジド修飾された蛍光色素によりCuAAC経由して、DNA合成後に標識するための完全な手順を示しています。これは、染料およびアルキン修飾DNAの合成と同様にラベリング手順を含みます。
色素の合成は、4つのステップに従います。すべての製品は、それらの正電荷のためにではなく、簡単な沈殿によって得ることができ、何時間のかかるカラムクロマ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ドイツ学術協会（DFG、ワ1386 / 17-1）によって財政支援、研究研修グループGRK 2039（DFGが資金提供）およびKITは深く感謝されています。
Materials
| synthesis | |||
| 4-Picoline | Sigma Aldrich | 239615 | |
| 1,3-Diiodopropane | Sigma Aldrich | 238414 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 10660131 | HPLC grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10456870 | technical grade |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | p.a. grade |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | 10626642 | technical grade |
| Indole-3-carboxaldehyde; 98% | ABCR | AB112969 | |
| Potassium carbonate, 99+% | Acros | 424081000 | |
| dimethylcarbonate | Sigma Aldrich | 517127 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve | Acros | 348435000 | |
| Sodium sulfate | Bernd Kraft | 12623.46 | |
| Ethanol, 99.5% | Acros | 397690010 | |
| Piperidine, 99% | Acros | 147181000 | |
| Diethylether | Fisher Scientific | 10407830 | technical grade |
| 2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97% | ABCR | AB125050 | |
| 4-Methylquinoline | ABCR | AB117222 | |
| DNA synthesis | |||
| Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer | Applied Biosystems | - | |
| DMT-dA(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | A111081 | |
| DMT-dT Phosphoramidite | Sigma Aldrich | T111081 | |
| DMT-dG(dmf) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | G11508 | |
| DMT-dC(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | C11108 | |
| Amidite Diluent for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010010 | |
| Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010400 | |
| Cap A | Sigma Aldrich | L840000 | |
| Cap B | Sigma Aldrich | L850000 | |
| CPG dT Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | T461010 | |
| CPG dA(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | A461010 | |
| CPG dG(ib) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | G461010 | |
| CPG dC(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | C461010 | |
| ammonia (aqueous solution) | Fluka Analytical | 318612 | |
| centrifugal devices nanosep 0.45 µm | Pall | ODGHPC34 | |
| 5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator) | Sigma Aldrich | 75666 | |
| 2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite | Chem Genes | ANP-7754 | |
| workup | |||
| vacuum concentrator | Christ | ||
| clicking procedure | |||
| Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate | Sigma Aldrich | 346276 | |
| Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| EDTA disodium salt | Sigma Aldrich | E5134 | |
| TBTA-ligand | - | - | synthesized according to a literature procedure [1] |
| HPLC | |||
| HPLC-system | Shimadzu | ||
| MALDI-Biflex-IV spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| LC-318 C18 column | Supelcosil via Sigma Aldrich | 58368 | |
| determination of concentration | |||
| ND 1000 Spectrophotometer | nanodrop | ||
| sample preparation and spectroscopy | |||
| Cary 100 Bio | Varian | ||
| Fluoromax-3 fluorimeter | Jobin-Yvon | ||
| [1] R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855. |
References
- Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging. Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).
- Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging. Chem. Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).
- Lee, J. S., Vendrell, M., Chang, Y. T. Diversity-oriented optical imaging probe development. Curr. Opin. Chem. Biol. 15 (6), 760-767 (2011).
- Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat. Biotechnol. 16 (1), 49-53 (1998).
- Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. #34;DNA Traffic Lights": Concept of Wavelength-Shifting DNA Probes and Application in an Aptasensor. ChemBioChem. 13 (8), 1136-1138 (2012).
- Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. DNA and RNA "Traffic Lights": Synthetic Wavelength-Shifting Fluorescent Probes Based on Nucleic Acid Base Substitutes for Molecular Imaging. J. Org. Chem. 78 (15), 7373-7379 (2013).
- Berndl, S., Wagenknecht, H. A. Fluorescent Color Readout of DNA Hybridization with Thiazole Orange as an Artificial DNA Base. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (13), 2418-2421 (2009).
- Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Synthesis of a Photostable Energy-Transfer Pair for "DNA Traffic Lights". Eur. J. Org. Chem. 34, 7547-7551 (2014).
- Walter, H. K., Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Development of a Wavelength-Shifting Fluorescent Module for the Adenosine Aptamer Using Photostable Cyanine Dyes. ChemistryOpen. 4 (2), 92-96 (2015).
- Gierlich, J., Burley, G. A., Gramlicj, P. M. E., Hammond, D. M., Carell, T. Click chemistry as a reliable method for the high-density postsynthetic functionalization of alkyne-modified DNA. Org. Lett. 8 (17), 3639-3642 (2006).
- Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. Synthesis of deoxyoligonucleotides on a polymer support. J. Am. Chem. Soc. 103 (11), 3185-3191 (1981).
- Fasman, G. D. . Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Volume 1: Nucleic Acids. , 589 (1975).
- Puglisi, J. D., Tinoco, J. I. Absorbance melting curves of RNA. Meth. Enzymol. 180, 304-325 (1989).
- Johansson, M. K., Fidder, H., Dick, D., Cook, R. M. Intramolecular Dimers: A New Strategy to Fluorescence Quenching in Dual-Labeled Oligonucleotide Probes. J. Am. Chem. Soc. 124, 6950-6956 (2002).
- Barrois, S., Wörner, S., Wagenknecht, H. A. The Role of Duplex Stability for Wavelength-Shifting Fluorescent DNA Probes: Energy Transfer vs Excition Interactions in DNA "Traffic Lights", Photochem. Photobiol. Sci. 13, 1126-1129 (2014).
