광안정 시아닌 염료는 올리고뉴클레오티드에 부착되어 에너지 전달에 의한 혼성화를 모니터링합니다.
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방법 논문
광 안정성 시아닌 염료를 사용하여 파장 변환 DNA 혼성화 프로브의 합성
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
이 프로토콜에서는 2'- 알킨의 합성 방법은 포스 표준 화학을 사용하여 자동화 고상 합성에 의해 디옥시리보 핵산 (DNA) 가닥을 변성 보여준다. 올리고 뉴클레오티드 후 합성 구리 촉매 클릭 화학 제를 사용하여 두 개의 새로운 광 안정성 시아닌 염료로 표시되어 있습니다. 모두 도너와 억 셉터 염료의 합성을 설명하고, 세 개의 연속 단계로 수행된다. 이들은 혼성화에 접할 때 주변 구조와 같은 DNA,이 두 염료의 에너지 전달을 겪는다. 따라서, 두 개의 단일 가닥의 DNA 가닥의 어닐링 형광 색의 변화에 의해 가시화된다. 이 색상 변화는 형광 분광 특징뿐만 아니라, 직접적으로 휴대용 자외선 (UV) 램프를 이용하여 관찰 할 수있다. 이중 색상 형광 판독 값의 개념은 이러한 올리고 뉴클레오티드 프로브를 분자 이미징 특히 기재된 포위한 우수한 툴을 만든다tostable 염료가 사용된다. 이에 따라, 이미징 프로브 광표백은 방지되고, 생물학적 과정은 긴 시간주기 동안 실시간으로 관찰 할 수있다.
서론
분자 이미징은 살아있는 세포 내에서 생물학적 과정을 이해하기위한 기본적인 기술을 나타냅니다. 1-3 화학적 생물학적 응용 프로그램에 대한 형광 핵산 기반 프로브의 개발이 확대 연구 분야가되고있다. 이 형광 프로브는 세포 이미징에 적합한 도구가 될 몇 가지 요구 사항을 충족해야합니다. 첫째, 적용 염료가 높은 양자 수율과 형광을 전시한다, 큰 스톡스 '변화는, 그리고 가장 중요한 것은, 높은 photostabilities는 생체 내 이미징의 장기를 허용합니다. 그리고 둘째로, 그들은 신뢰할 수있는 형광 판독을 표시해야합니다. 종래 발색단 소광-시스템은 형광 농도의 간단한 변경에 의해 하나의 형광 색의 판독에 기초한다. (4)이 접근법으로 인해 세포 내 성분 또는 낮은 신호대 잡음비의 형광도에 위양성 혹은 위음성 결과의 위험을 부담 때문에 다른 COM에 의해 원치 않는 담금질에ponents. 4
최근 개의 상이한 발색단을 사용하여 이중 형광 색 판독을 표시 "DNA 신호등"의 개념을보고 하였다. 5-6 개념은 형광 변화 셉터 염료 도너 염료의 에너지 전달 (ET)에 기초 컬러 (도 1 참조). 이는보다 안정적....
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프로토콜
주의 : 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 이 합성에 사용 된 화학 물질 중 일부는 독성 및 발암 성이다. 일반적으로, 실험실 코트를 입고 안전 안경, 장갑 등의 유기 화학 실험실에 필요한 모든 적절한 안전 방법을 사용하십시오.
염료의 1. 합성
. 두 염료가 반응 동일한 유형으로 합성 할 수있다 (2) 이러한 반응의 개요를 보여줍니다 :합니다.
- 1- (3- 아지도 프로필)의 합성 -4- (2- (1- 메틸 -1H- 인돌 -3- 일) 비닐) 피리딘 -1- 윰 아이오다 이드 (염료 1)
- 1- (3- 아이오도 프로필) -4- 메틸 -1- 윰 아이오다 이드의 합성 (도 2a는, 단계 a)
- 녹여 466 mg의 4- 피 콜린 및 5.91 g 20 ML의 헤드 스페이스 바이알에 아세토 니트릴 10 ㎖에 1,3- diiodopropane 및 격벽 캡으로 단단히 밀봉.
- 16 시간 동안 85 ° C까지 가열한다.
- 그 후, RT로 냉각 회전 증발기를 사용하여 ....
- 1- (3- 아이오도 프로필) -4- 메틸 -1- 윰 아이오다 이드의 합성 (도 2a는, 단계 a)
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결과
도 4에 도시 된 바와 같이, 단일 및 이중 가닥 DNA의 흡수 및 형광 스펙트럼을 기록한다.
기록 된 흡수 스펙트럼 (그림 4 오른쪽) 단일 가닥 DNA1 (염료 1) 및 단일 가닥 DNA2 (염료 2)에 대한 546 nm의 465 nm에서 쇼 흡수 최대의 λ 최대. 어닐링 DNA1_2 (염료 1 염료 2) 469 nm 내지 567 nm의 모두에서 최대 값을 보여줍니다. 모두 최대 흡수는 장파장 이동, 염료 1 4 nm의 이러한 작은 분광 변화가 이중 나선 DNA 구조 내에서 염료 사이의 엑시톤 상호 작용의 결과 염료 2에 대한 21 나노을 보여줍니다.
하나를위한 607.......
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토론
이 프로토콜은 아 지드 수정 형광 염료에 의해 CuAAC 통해 DNA 후 합성 레이블의 전체 과정을 보여줍니다. 이 염료 및 알킨 변성 DNA의 합성뿐만 아니라, 표시 순서를 포함한다.
염료의 합성은 네 단계를 따른다. 모든 제품은 그들의 양전하로 비교적 간단 침전에 의해 수득 할 수 있고 시간 소모적 컬럼 크로마토 그래피는 필요하지 않다. 중앙 커플 링 단계 이전에 아 지드 기능의 도입은 네 대신 5 개의 연속 반응 단계에 염료의 합성을 단축. 1,3- diiodopropane 대신 알킬화 공정은 아펠 반응 및 요오 작용기로 수산기 함수 변환 다음 Finkelstein 반응을위한 3 iodopropanol의 적용을 회피 하였다. 게시 된 절차에 비해 이러한 변화는 우리가 더 큰 규모와 시간의 짧은 기간에 염료를 합성 할 수 있습니다.
인가 염료는 우수한 광 안정성 아니라 고상 DNA 합성 및 후 처리시 .......액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
독일 연구 협회 (DFG, 1386 / 17-1 워싱턴)에 의해 재정 지원 연구 교육 그룹 (DFG에 의해 자금) GRK 2039 및 KIT는 기꺼이 인정한다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| < 강>합성< / 강> | |||
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| 1,3-Diiodopropane | 시그마 Aldrich | 238414 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 10660131 | HPLC 등급 |
| 에틸 아세테이트 | Fisher Scientific | 10456870 | 기술 등급 |
| 아지드 나트륨 | 시그마 알드리치 | 71290 | p.a. 등급 |
| 디클로로메탄 | 피셔 사이언티픽 | 10626642 | 기술 등급 |
| 인돌-3-카르복스알데히드;98% | ABCR | AB112969 | |
| 탄산칼륨, 99+% | 아크로스 | 424081000 | |
| 디메틸카보네이 | 시그마 알드리치 | 517127 | |
| N,N-디메틸포름아미드, 99.8 %, 분자체 | Acros | 348435000 | |
| 황산 나트륨 | Bernd Kraft | 12623.46 | |
| 에탄올, 99.5 % | 397690010 | ||
| 피 페리 딘, 99 % | 147181000 | ||
| Diethylether | Fisher Scientific | 10407830 | 기술 등급 |
| 2- 페닐 인돌 -3- 카르 복스 알데히드; 97 % | ABCR | AB125050 | |
| 4-메틸퀴놀린 | ABCR | AB117222 | |
| DNA synthesis | |||
| Expedite 8909 핵산 합성제 | Applied Biosystems | - | |
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| 1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855. |
참고문헌
- Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging. Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).
- Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging. Chem. Rev.
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