Syntese af bølgelængden-shifting DNA hybridiseringsprober ved hjælp fotostabile cyaninfarvestoffer
Summary
Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.
Abstract
I denne protokol, viser vi en fremgangsmåde til syntese af 2'-alkyn modificeret deoxyribonukleinsyre (DNA) strenge ved automatiseret fastfasesyntese under anvendelse af standard phosphoramiditkemi. Oligonucleotider post-syntetisk mærket med to nye fotostabile cyaninfarvestoffer anvendelse af kobber-katalyseret click-kemi. Syntesen af både donoren og acceptoren farvestof er beskrevet og udføres i tre på hinanden følgende trin. Med DNA som den omgivende arkitektur, disse to farvestoffer gennemgå en energioverførsel, når de bringes i tæt nærhed ved hybridisering. Derfor er annealing af to enkeltstrengede DNA-strenge visualiseret ved en ændring af fluorescens farve. Denne farveændring er kendetegnet ved fluorescensspektroskopi men kan også observeres direkte ved hjælp af en håndholdt ultraviolet (UV) lampe. Begrebet en dobbelt fluorescens farve udlæsning gør disse oligonukleotidprober fremragende værktøjer til molekylær billeddannelse, især når den beskrevne photostable farvestoffer anvendes. Derved fotoblegning af de billeddannende prober forhindres, og biologiske processer kan observeres i realtid i en længere tidsperiode.
Introduction
Molekylær billeddannelse er en grundlæggende teknik til at forstå biologiske processer i levende celler. 1-3 Udviklingen af fluorescerende nukleinsyre baserede prober til sådanne kemiske-biologiske applikationer er blevet en ekspanderende forskningsområde. Disse fluorescerende prober skal opfylde nogle krav for at blive egnede værktøjer til cell imaging. For det første bør de anvendte farvestoffer udviser fluorescens med høj kvante udbytter, stor Stokes 'skift og, vigtigst af alt, høje photostabilities at tillade langsigtet in vivo imaging. Og for det andet skal de vise en pålidelig fluorescens udlæsning. Konventionel kromofor-quencher-systemer er baseret på udlæsningen af en enkelt fluorescens farve ved simple ændringer i fluorescensintensiteter. 4 Denne model en risiko for falske positive eller falske negative resultater på grund af autofluorescens af intracellulære komponenter eller lave signal-til-støj-forhold på grund af uønsket quenching af andre comnenter. 4
Vi har for nylig rapporteret om begrebet "DNA trafiklys", der viser dobbelt fluorescens farve udlæsninger ved hjælp af to forskellige kromoforer. 5-6 Konceptet er baseret på energioverførsel (ET) fra donor farvestof til acceptor farvestof, som ændrer fluorescens farve (se figur 1). Dette giver en mere pålidelig udlæsning og dermed giver et kraftfuldt værktøj til fluorescerende billeddannelse sonder. Mærkning af oligonukleotider med fluorescerende farvestoffer kan opnås ved to forskellige fremgangsmåder. Farvestoffer kan inkorporeres under den kemiske DNA-syntese på en fast fase ved anvendelse af tilsvarende modificerede phosphoramidit byggesten. 7 Denne fremgangsmåde er begrænset til farvestoffer, der er stabilt under standard phosphoramidit og afbeskyttelsesbetingelser. Som et alternativ, blev post-syntetiske modifikation metodikker etableret i oligonukleotidkemi. Her demonstrerer vi syntesen af en af vores nye billedertabel energioverførsel par 8,9 og post-syntetisk mærkning af DNA ved hjælp af kobber-katalyseret 1,3-cycloaddition mellem azider og alkyner (CuAAC). 10
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol viser den fuldstændige procedure til at mærke DNA post-syntetisk via CuAAC af azid-modificerede fluorescerende farvestoffer. Dette omfatter syntesen af farvestofferne og alkyn-modificeret DNA samt proceduren mærkning.
Syntesen af farvestofferne følger fire trin. Alle produkter kan opnås ved en ret simpel udfældning på grund af deres positive ladning og der kræves ikke tidskrævende søjlekromatografi. Indførelsen af azidet funktionaliteter ved den ce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Økonomisk støtte fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Wa 1386 / 17-1), Research Training Group GRK 2039 (finansieret af DFG) og KIT er taknemmeligt anerkendt.
Materials
| synthesis | |||
| 4-Picoline | Sigma Aldrich | 239615 | |
| 1,3-Diiodopropane | Sigma Aldrich | 238414 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 10660131 | HPLC grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10456870 | technical grade |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | p.a. grade |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | 10626642 | technical grade |
| Indole-3-carboxaldehyde; 98% | ABCR | AB112969 | |
| Potassium carbonate, 99+% | Acros | 424081000 | |
| dimethylcarbonate | Sigma Aldrich | 517127 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve | Acros | 348435000 | |
| Sodium sulfate | Bernd Kraft | 12623.46 | |
| Ethanol, 99.5% | Acros | 397690010 | |
| Piperidine, 99% | Acros | 147181000 | |
| Diethylether | Fisher Scientific | 10407830 | technical grade |
| 2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97% | ABCR | AB125050 | |
| 4-Methylquinoline | ABCR | AB117222 | |
| DNA synthesis | |||
| Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer | Applied Biosystems | - | |
| DMT-dA(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | A111081 | |
| DMT-dT Phosphoramidite | Sigma Aldrich | T111081 | |
| DMT-dG(dmf) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | G11508 | |
| DMT-dC(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | C11108 | |
| Amidite Diluent for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010010 | |
| Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010400 | |
| Cap A | Sigma Aldrich | L840000 | |
| Cap B | Sigma Aldrich | L850000 | |
| CPG dT Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | T461010 | |
| CPG dA(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | A461010 | |
| CPG dG(ib) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | G461010 | |
| CPG dC(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | C461010 | |
| ammonia (aqueous solution) | Fluka Analytical | 318612 | |
| centrifugal devices nanosep 0.45 µm | Pall | ODGHPC34 | |
| 5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator) | Sigma Aldrich | 75666 | |
| 2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite | Chem Genes | ANP-7754 | |
| workup | |||
| vacuum concentrator | Christ | ||
| clicking procedure | |||
| Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate | Sigma Aldrich | 346276 | |
| Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| EDTA disodium salt | Sigma Aldrich | E5134 | |
| TBTA-ligand | - | - | synthesized according to a literature procedure [1] |
| HPLC | |||
| HPLC-system | Shimadzu | ||
| MALDI-Biflex-IV spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| LC-318 C18 column | Supelcosil via Sigma Aldrich | 58368 | |
| determination of concentration | |||
| ND 1000 Spectrophotometer | nanodrop | ||
| sample preparation and spectroscopy | |||
| Cary 100 Bio | Varian | ||
| Fluoromax-3 fluorimeter | Jobin-Yvon | ||
| [1] R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855. |
References
- Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging. Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).
- Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging. Chem. Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).
- Lee, J. S., Vendrell, M., Chang, Y. T. Diversity-oriented optical imaging probe development. Curr. Opin. Chem. Biol. 15 (6), 760-767 (2011).
- Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat. Biotechnol. 16 (1), 49-53 (1998).
- Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. #34;DNA Traffic Lights": Concept of Wavelength-Shifting DNA Probes and Application in an Aptasensor. ChemBioChem. 13 (8), 1136-1138 (2012).
- Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. DNA and RNA "Traffic Lights": Synthetic Wavelength-Shifting Fluorescent Probes Based on Nucleic Acid Base Substitutes for Molecular Imaging. J. Org. Chem. 78 (15), 7373-7379 (2013).
- Berndl, S., Wagenknecht, H. A. Fluorescent Color Readout of DNA Hybridization with Thiazole Orange as an Artificial DNA Base. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (13), 2418-2421 (2009).
- Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Synthesis of a Photostable Energy-Transfer Pair for "DNA Traffic Lights". Eur. J. Org. Chem. 34, 7547-7551 (2014).
- Walter, H. K., Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Development of a Wavelength-Shifting Fluorescent Module for the Adenosine Aptamer Using Photostable Cyanine Dyes. ChemistryOpen. 4 (2), 92-96 (2015).
- Gierlich, J., Burley, G. A., Gramlicj, P. M. E., Hammond, D. M., Carell, T. Click chemistry as a reliable method for the high-density postsynthetic functionalization of alkyne-modified DNA. Org. Lett. 8 (17), 3639-3642 (2006).
- Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. Synthesis of deoxyoligonucleotides on a polymer support. J. Am. Chem. Soc. 103 (11), 3185-3191 (1981).
- Fasman, G. D. . Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Volume 1: Nucleic Acids. , 589 (1975).
- Puglisi, J. D., Tinoco, J. I. Absorbance melting curves of RNA. Meth. Enzymol. 180, 304-325 (1989).
- Johansson, M. K., Fidder, H., Dick, D., Cook, R. M. Intramolecular Dimers: A New Strategy to Fluorescence Quenching in Dual-Labeled Oligonucleotide Probes. J. Am. Chem. Soc. 124, 6950-6956 (2002).
- Barrois, S., Wörner, S., Wagenknecht, H. A. The Role of Duplex Stability for Wavelength-Shifting Fluorescent DNA Probes: Energy Transfer vs Excition Interactions in DNA "Traffic Lights", Photochem. Photobiol. Sci. 13, 1126-1129 (2014).
