द्वारा शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन का पता लगाने<em> इन विट्रो</emवसाकोशिका संस्कृति में> आरएनए पुल से नीचे
Summary
एक शाही सेना पुल से नीचे प्रोटोकॉल यहाँ आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन (RBPs) और noncoding के रूप में भी कोडिंग RNAs के बीच बातचीत का पता लगाने के लिए अनुकूलित है। एण्ड्रोजन रिसेप्टर (एआर) से एक शाही सेना टुकड़ा प्रदर्शित करने के लिए कैसे प्राथमिक भूरे रंग adipocytes के lystate से अपने RBP पुनः प्राप्त करने के लिए एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया गया था।
Abstract
शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन (RBPs) के विकास और वसा के समारोह में एक नियामक परत के रूप में उभर रहे हैं। RBPs लक्ष्य mRNAs की स्थिरता और translational दक्षता को प्रभावित करने से posttranscriptional स्तरों पर जीन अभिव्यक्ति विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। आरएनए पुल से नीचे तकनीक का व्यापक रूप आरएनए प्रोटीन बातचीत, जो तंत्र अंतर्निहित RBPs 'के रूप में अच्छी तरह से लंबे समय से गैर-कोडिंग RNAs' (lncRNAs) समारोह को स्पष्ट करने के लिए आवश्यक है अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, adipocytes में उच्च लिपिड बहुतायत इस प्रयोग के संचालन में एक तकनीकी चुनौती बन गया है। यहाँ एक विस्तृत आरएनए पुल से नीचे प्रोटोकॉल प्राथमिक वसाकोशिका संस्कृति के लिए अनुकूलित है। एण्ड्रोजन रिसेप्टर के (एआर) 3 'untranslated क्षेत्र (3'UTR) एक adenylate-uridylate अमीर कैसे प्रदर्शित करने वसाकोशिका lystate से, अपने RBP साथी, हूर प्रोटीन को पुनः प्राप्त करने के लिए एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया elementwas युक्त से एक शाही सेना टुकड़ा। विधि यहाँ वर्णित के बीच बातचीत का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता हैRBPs और noncoding RNAs, साथ ही बीच RBPs और कोडिंग RNAs।
Introduction
RBPs प्रोटीन है कि कोशिकाओं में डबल या एकल असहाय शाही सेना के लिए बाध्य और आरएनए प्रोटीन परिसरों के गठन में भाग रहे हैं। RBPs mRNA और लंबे noncoding RNAs (lncRNAs) सहित आरएनए प्रजातियों की एक किस्म के लिए बाध्य, और बाद ट्रांसक्रिप्शनल स्तरों पर उनके प्रभाव डालती सकता है। दोनों RBPs और lncRNAs वसा विकास के रूप में उपन्यास नियामकों उभर रहा है और 1,2,3 समारोह कर रहे हैं। RBP- की व्यवस्था और सेलुलर रास्ते में से lncRNA की मध्यस्थता विनियमन समझने के लिए, यह अक्सर एक विशिष्ट आरएनए अणु और एक या कई RBPs के बीच बातचीत का पता लगाने के लिए आवश्यक है, और, कभी कभी, एक शाही सेना के प्रोटीन भागीदारों की पूर्ण स्पेक्ट्रम की पहचान के लिए प्रतिलेख। हालांकि, प्रयोग adipocytes में लिपिड की उच्च सामग्री के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है। आरएनए पुल से नीचे प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित प्राथमिक संस्कृतियों 4,5 के वसाकोशिका lysates से एक विशिष्ट शाही सेना के प्रोटीन के भागीदारों को पुनः प्राप्त करने के लिए नियोजित किया जा सकता है।
इस आद्य के लिए तर्ककर्नल के रूप में संक्षेप है। एक शाही सेना चारा एक डीएनए टेम्पलेट से लिखित विट्रो में है, बायोटिन लेबल और streptavidin लेपित चुंबकीय मोतियों से 4 संयुग्मित। आरएनए चारा आरएनए प्रोटीन परिसरों, जो बाद में एक चुंबकीय स्टैंड पर नीचे खींच रहे हैं के गठन के लिए अनुमति देने के लिए सेलुलर lysates साथ incubated है। अधिक विशेष रूप से, आरएनए पुल से नीचे प्रोटोकॉल नीचे वर्णित हूर प्रोटीन, एक सार्वभौमिक व्यक्त RBP, mRNAs 6.7 की 3'UTR के लिए बाध्य प्राथमिक संस्कृति के theadipocytelysate से पुनः प्राप्त करने के लिए प्रलोभन के रूप में एआर 3'UTR से एक शाही सेना टुकड़ा का उपयोग करें। इस परख के बंधन विशिष्टता का परीक्षण करने के लिए, एक गैर-प्रासंगिक RNAas साथ ही खाली streptavidin मोतियों नियंत्रण के रूप में शामिल किया गया है। इस प्रोटोकॉल एक विशिष्ट RBP का कब्जा पुष्टि करने के लिए या कब्जा कर लिया RBPs क्रमश: 8 से भरा प्रदर्शनों की सूची की पहचान करने के लिए पश्चिमी सोख्ता या मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) के साथ संगत है।
कई तकनीकों आरएनए प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध हैंएस। एक दिया RBP, चीर (आरएनए immunoprecipitation) और क्लिप (यूवी crosslinking और immunoprecipitation) से बंधे RNAs प्रकट करने के लिए लागू किया जा सकता है। इसके विपरीत, एक दिया शाही सेना के प्रोटीन भागीदारों की पहचान करने के लिए, शाही सेना पुल से नीचे, कलरव (आरएनए शुद्धि द्वारा क्रोमेटिन अलगाव), चार्ट (आरएनए लक्ष्य का कब्जा संकरण विश्लेषण) और आरएपी (आरएनए antisense शुद्धि) लागू किया जा सकता है। बाद में लोगों के साथ तुलना में, आरएनए पुल से नीचे तकनीक स्थापित करने के लिए कम प्रयास लेता है। यह इन विट्रो में और vivo में प्रोटीन पर कब्जा करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। आरएनए पुल से नीचे है, जो अपने इन विट्रो समकक्ष से तकनीकी रूप से और अधिक चुनौतीपूर्ण है, के vivo दृष्टिकोण कोशिकाओं में crosslinking द्वारा आरएनए प्रोटीन बातचीत को बरकरार रखता है, कोशिकाओं से ब्याज की aptamer टैग RNAs कब्जा, और बाद में बाध्य RBPs पता लगाता है। आरएनए पुल से नीचे कम प्रचुर मात्रा में RBPs को समृद्ध, और अलग-थलग और सेलुलर विनियमन 9,10 नियंत्रित करने में आरएनए प्रोटीन परिसरों है कि विविध कार्यात्मक भूमिका की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता </s> अप।
Protocol
Representative Results
Discussion
lncRNAs और RBPs स्वास्थ्य और रोग में महत्वपूर्ण भूमिका है, लेकिन इन अणुओं के आणविक तंत्र खराब समझ रहे हैं। प्रोटीन है कि lncRNA अणुओं के साथ बातचीत की पहचान विनियामक तंत्र elucidating की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम है। आरए…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम सिंगापुर एनआरएफ फैलोशिप (एनआरएफ-2011NRF-NRFF001-025) के साथ ही CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Major materials used in this study. | |||
| MEGAscript kit | Ambion | ||
| Biotin-14-CTP | Invitrogen | ||
| NucAway spin columns | Ambion | ||
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | ||
| HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261) | Santa Cruz Biotechnology | ||
| Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005) | Santa Cruz Biotechnology | ||
| Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free) | HyClone | ||
| Phosphate Buffer Saline (1×PBS) | HyClone | ||
| RNase inhibitor | Bioline | ||
| Protease inhibitor | Sigma | ||
| Pfu Turbo DNA polymerase | Agilent Technologies | ||
| TRIsure | Bioline | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Major equipment used in this study. | |||
| Sorvall Legend Micro 21R centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Sorvall Legend X1R centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Bio-Rad T100 thermal cycler | Bio-Rad | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| BOECO rotator Multi Bio RS-24 | BOECO,Germany | ||
| Protein gel electrophoresis and blotting apparatus | Bio-Rad | ||
| DynaMag-2 magnet | Life Technologies |
References
- Huot, M. &. #. 2. 0. 1. ;., et al. The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis. Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).
- Sun, L., et al. Long noncoding RNAs regulate adipogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3387-3392 (2013).
- Engreitz, J. M., et al. The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X-chromosome. Science. 341 (6147), 1237973 (2013).
- Zhao, X. Y., Li, S., Wang, G. X., Yu, Q., Lin, J. D. A long noncoding RNA transcriptional regulatory circuit drives thermogenic adipocyte differentiation. Mol Cell. 55, 372-382 (2014).
- Alvarez-Dominguez, J. R., et al. De novo reconstruction of adipose tissue transcriptomes reveals long non-coding RNA regulators of brown adipocyte development. Cell Metab. 21, 764-776 (2015).
- Adams, D. J., Beveridge, D. J., van der Weyden, L., Mangs, H., Leedman, P. J., Morris, B. J. HADHB, HuR, and CP1 bind to the distal 3-untranslated region of human renin mRNA and differentially modulate renin expression. J Biol Chem. 278 (45), 44894-44903 (2003).
- Yeap, B. B., et al. Novel binding of HuR and poly(C)-binding protein to a conserved UC-rich motif within the 3´ untranslated region of the androgen receptor messenger RNA. J Biol Chem. 277, 27183-27192 (2002).
- König, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives. Nat Rev Genet. 13, 77-83 (2012).
- Ferrè, F., Colantoni, A., Helmer-Citterich, M. Revealing protein-lncRNA interaction. Briefings in Bioinformatics. , 1-11 (2015).
- McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15 (1), 203 (2014).
- Lee, Y. S., et al. AU-rich element-binding protein negatively regulates CCAAT enhancer binding protein mRNA stability during long term synaptic plasticity in Aplysia. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15520-15525 (2012).
- Hermann, M., Cermak, T., Voytas, D. F., Pelczar, P. Mouse genome engineering using designer nucleases. J Vis Exp. (86), (2014).
- Tsai, M. C., et al. Long Noncoding RNA as Modular Scaffold of Histone Modification Complexes. Science. 329 (5992), 689-693 (2010).
- Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505, 706-709 (2014).
- Li, H., et al. Identification of mRNA binding proteins that regulate the stability of LDL receptor mRNA through AU rich elements. J Lipid Res. 50 (5), 820-831 (2009).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
- Chu, C., et al. Systematic Discovery of Xist RNA Binding Proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs. Nat Struct Mol Biol. 22 (1), 29-35 (2015).
- Zhao, J., et al. Genome-wide identification of Polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).
