Detectie van RNA-bindende eiwitten door<em> In Vitro</em> RNA Pull-down in Adipocyte Cultuur
Summary
Een RNA-pull-down protocol is hier geoptimaliseerd voor detectie van interacties tussen RNA-bindende eiwitten (RBPs) en niet-coderende en coderende RNAs. Een RNA fragment uit androgeenreceptor (AR) werd gebruikt als een voorbeeld om te demonstreren hoe de RBP halen uit lystate primaire bruine adipocyten.
Abstract
RNA-bindende eiwitten (RBPs) ontstaan als een regulerende laag in de ontwikkeling en functie van vet. RBPs spelen een sleutelrol in de regulatie van genexpressie op post-transcriptionele niveau door dat de stabiliteit en translationele efficiëntie van doelwit mRNA. RNA pull-down techniek wordt veel gebruikt om RNA-eiwit interactie die nodig is om het onderliggende mechanisme helderen (lncRNAs) functie RBPs "als lange niet-coderende RNA's te bestuderen. De hoge lipide overvloed in adipocyten vormt een technisch probleem bij het uitvoeren van dit experiment. Hier een gedetailleerd RNA pull-down protocol is geoptimaliseerd voor primaire adipocyten cultuur. Een RNA-fragment uit (AR) 3 'onvertaalde regio androgene receptor (3'UTR) die een adenylaat-uridylate-rijk elementwas als voorbeeld gebruikt om te demonstreren hoe de RBP partner, Hur eiwit op te halen, uit adipocyten lystate. De hier beschreven methode kan worden toegepast op de interacties tussen detecterenRBPs en niet-coderende RNA's, alsook tussen RBPs en codering RNA's.
Introduction
RBPs zijn eiwitten die binden aan een dubbele of enkelstrengs RNA in cellen en participeren in het RNA-eiwitcomplexen. RBPs kunnen verschillende RNA soorten, waaronder mRNA en lange niet-coderende RNA's (lncRNAs) binden en hun invloed op post-transcriptioneel niveau uitoefenen. Zowel RBPs en lncRNAs zijn in opkomst als nieuwe regulatoren in het vet- ontwikkeling en functioneren 1,2,3. Het mechanisme van RBP- en lncRNA gemedieerde regulering van cellulaire routes begrijpen, is het vaak nodig om de interactie tussen een specifiek RNA-molecuul en één of meer RBPs detecteren, en soms het volledige spectrum van eiwit partners van een RNA identificeren vertaling. Echter, het experiment uitdaging vanwege het hoge gehalte aan lipiden in adipocyten. Het RNA pull-down protocol beschreven kunnen worden toegepast om het eiwit partners van een specifiek RNA van de adipocyten lysaten van primaire kweken 4,5 halen.
Reden voor deze protocol wordt als volgt samengevat. Een RNA aas in vitro getranscribeerd vanaf een DNA-matrijs, met biotine gemerkt en geconjugeerd aan met streptavidine beklede magnetische korrels 4. Het RNA aas wordt geïncubeerd met cellysaten, teneinde de vorming van RNA-eiwitcomplexen, die vervolgens neer op een magnetische standaard worden getrokken. Meer specifiek hieronder beschreven het RNA pull-down-protocol een RNA-fragment uit AR 3'UTR als aas om Hur eiwit, een universeel uitgedrukt RBP gebonden aan 3'UTR van mRNA 6,7, van theadipocytelysate van primaire kweek te halen. Om de bindingsspecificiteit van deze assay wordt een niet-relevante RNAas en leeg streptavidineparels opgenomen als controle. Dit protocol is compatibel met western blotting of massaspectrometrie (MS) om de vangst van een specifieke RBP te bevestigen of het volledige repertoire van gevangen RBPs respectievelijk 8 identificeren.
Verschillende technieken beschikbaar voor RNA-eiwit interactie te bestuderens. Om RNAs gebonden door een bepaalde RBP, RIP (RNA immunoprecipitatie) en CLIP (UV crosslinking en immuunprecipitatie) zichtbaar kan worden toegepast. Daarentegen eiwit partners van een bepaald RNA identificeren RNA pull-down, Chirp (chromatine isolatie van RNA zuivering), GRAFIEK (capture hybridisatie-analyse van RNA targets) en RAP (antisense RNA zuivering) kunnen worden toegepast. In vergelijking met de latere, RNA pull-down methode vergt minder inspanning te zetten. Het kan worden toegepast om eiwitten te vangen in vitro en in vivo. De in vivo benadering van RNA pull-down, dat is technisch gezien een grotere uitdaging dan de in vitro tegenhanger, behoudt RNA-eiwit interacties door het verknopen in cellen, vangt-aptameer gelabeld RNA's van de belangstelling van de cellen, en vervolgens gebonden RBPs detecteert. RNA vervolgmenu kan worden gebruikt om lage overvloedige RBPs verrijken en isoleren en identificeren van de RNA-eiwitcomplexen die verschillende functionele rollen hebben bij het regelen cellulaire regulatie 9,10 </sup>.
Protocol
Representative Results
Discussion
lncRNAs RBPs en hebben vitale rol in gezondheid en ziekte, maar de moleculaire mechanismen van deze moleculen worden slecht begrepen. Identificatie van eiwitten die interageren met lncRNA moleculen een belangrijke stap naar het ophelderen van de regulatiemechanismen. Verrijking van RBPs door RNA pull-down assay is gebaseerd op in-oplossing vangst van samenwerkend complex waardoor eiwitten uit een cellysaat selectief worden geëxtraheerd met behulp van gebiotinyleerd RNA aas gebonden aan streptavidine magnetische korrels…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door Singapore NRF Fellowship (NRF-2011NRF-NRFF001-025) als CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014).
Materials
| Major materials used in this study. | |||
| MEGAscript kit | Ambion | ||
| Biotin-14-CTP | Invitrogen | ||
| NucAway spin columns | Ambion | ||
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | ||
| HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261) | Santa Cruz Biotechnology | ||
| Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005) | Santa Cruz Biotechnology | ||
| Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free) | HyClone | ||
| Phosphate Buffer Saline (1×PBS) | HyClone | ||
| RNase inhibitor | Bioline | ||
| Protease inhibitor | Sigma | ||
| Pfu Turbo DNA polymerase | Agilent Technologies | ||
| TRIsure | Bioline | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Major equipment used in this study. | |||
| Sorvall Legend Micro 21R centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Sorvall Legend X1R centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Bio-Rad T100 thermal cycler | Bio-Rad | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| BOECO rotator Multi Bio RS-24 | BOECO,Germany | ||
| Protein gel electrophoresis and blotting apparatus | Bio-Rad | ||
| DynaMag-2 magnet | Life Technologies |
References
- Huot, M. &. #. 2. 0. 1. ;., et al. The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis. Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).
- Sun, L., et al. Long noncoding RNAs regulate adipogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3387-3392 (2013).
- Engreitz, J. M., et al. The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X-chromosome. Science. 341 (6147), 1237973 (2013).
- Zhao, X. Y., Li, S., Wang, G. X., Yu, Q., Lin, J. D. A long noncoding RNA transcriptional regulatory circuit drives thermogenic adipocyte differentiation. Mol Cell. 55, 372-382 (2014).
- Alvarez-Dominguez, J. R., et al. De novo reconstruction of adipose tissue transcriptomes reveals long non-coding RNA regulators of brown adipocyte development. Cell Metab. 21, 764-776 (2015).
- Adams, D. J., Beveridge, D. J., van der Weyden, L., Mangs, H., Leedman, P. J., Morris, B. J. HADHB, HuR, and CP1 bind to the distal 3-untranslated region of human renin mRNA and differentially modulate renin expression. J Biol Chem. 278 (45), 44894-44903 (2003).
- Yeap, B. B., et al. Novel binding of HuR and poly(C)-binding protein to a conserved UC-rich motif within the 3´ untranslated region of the androgen receptor messenger RNA. J Biol Chem. 277, 27183-27192 (2002).
- König, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives. Nat Rev Genet. 13, 77-83 (2012).
- Ferrè, F., Colantoni, A., Helmer-Citterich, M. Revealing protein-lncRNA interaction. Briefings in Bioinformatics. , 1-11 (2015).
- McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15 (1), 203 (2014).
- Lee, Y. S., et al. AU-rich element-binding protein negatively regulates CCAAT enhancer binding protein mRNA stability during long term synaptic plasticity in Aplysia. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15520-15525 (2012).
- Hermann, M., Cermak, T., Voytas, D. F., Pelczar, P. Mouse genome engineering using designer nucleases. J Vis Exp. (86), (2014).
- Tsai, M. C., et al. Long Noncoding RNA as Modular Scaffold of Histone Modification Complexes. Science. 329 (5992), 689-693 (2010).
- Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505, 706-709 (2014).
- Li, H., et al. Identification of mRNA binding proteins that regulate the stability of LDL receptor mRNA through AU rich elements. J Lipid Res. 50 (5), 820-831 (2009).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
- Chu, C., et al. Systematic Discovery of Xist RNA Binding Proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs. Nat Struct Mol Biol. 22 (1), 29-35 (2015).
- Zhao, J., et al. Genome-wide identification of Polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).
