الكشف عن البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي<em> في المختبر</em> RNA المنسدلة في خلية شحمية الثقافة
Summary
هو الأمثل بروتوكول المنسدلة RNA هنا للكشف عن التفاعلات بين البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي (الممارسات التجارية التقييدية) وغير مكود، وكذلك الرنا الترميز. تم استخدام جزء من الحمض النووي الريبي مستقبلات الاندروجين (AR) كمثال لشرح كيفية استرداد الممارسات التجارية التقييدية في الفترة من lystate من الخلايا الشحمية البنية الأساسية.
Abstract
البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي (الممارسات التجارية التقييدية) وتظهر على شكل طبقة التنظيمية في تطوير وظيفة الدهنية. الممارسات التجارية التقييدية تلعب دورا رئيسيا في تنظيم التعبير الجيني في مستويات posttranscriptional التي تؤثر على الاستقرار ومتعدية كفاءة من mRNAs الهدف. وقد استخدم RNA تقنية المنسدلة على نطاق واسع لدراسة تفاعل الحمض النووي الريبي البروتين، وهو أمر ضروري لتوضيح الآلية الكامنة وراء وظيفة الممارسات التجارية التقييدية "وكذلك الرنا غير الترميز طويلة" (lncRNAs). ومع ذلك، فإن وفرة الدهون عالية في الخلايا الشحمية تشكل تحديا تقنيا في إجراء هذه التجربة. هنا هو الأمثل بروتوكول مفصلة المنسدلة RNA للثقافة خلية شحمية الأولية. شظية من الحمض النووي الريبي (AR) 3 'المنطقة غير مترجمة مستقبلات الاندروجين في (3'UTR) التي تحتوي على elementwas-محلقة uridylate الغنية تستخدم كمثال لشرح كيفية استرداد الشريك الممارسات التجارية التقييدية لها، البروتين حور من lystate خلية شحمية. الطريقة الموصوفة هنا يمكن تطبيقها للكشف عن التفاعلات بينالممارسات التجارية التقييدية والرنا غير المرمزة noncoding الموجودة، وكذلك بين الممارسات التجارية التقييدية والرنا الترميز.
Introduction
الممارسات التجارية التقييدية هي البروتينات التي ربط مزدوج أو واحد الحمض النووي الريبي RNA في الخلايا والمشاركة في تشكيل المجمعات الحمض النووي الريبي البروتين. الممارسات التجارية التقييدية قد ربط مجموعة متنوعة من الأنواع RNA، بما في ذلك مرنا والرنا غير المكودة طويلة (lncRNAs)، وتمارس تأثيرها على مستويات ما بعد النسخي. كل من الممارسات التجارية التقييدية وlncRNAs والمنظمين كما جديدة بدأت تظهر في التنمية الدهنية وتعمل 1،2،3. لفهم آلية RBP- وتنظيم بوساطة lncRNA مسارات الخلوية، فإنه غالبا ما يكون ضروريا للكشف عن التفاعل بين جزيء RNA محددة واحدة أو عدة الممارسات التجارية التقييدية، وأحيانا، إلى تحديد مجموعة كاملة من الشركاء البروتين من الحمض النووي الريبي نسخة. ومع ذلك، يمكن للتجربة أن يكون تحديا نظرا لنسبة عالية من الدهون في الخلايا الشحمية. بروتوكول المنسدلة RNA هو موضح هنا يمكن استخدام لاسترداد الشركاء البروتين من الحمض النووي الريبي محددة من لست] خلية شحمية من الثقافات الأولية 4،5.
الأساس المنطقي لهذا بروتوولخص العقيد على النحو التالي. والطعم RNA هو كتب في المختبر من قالب الحمض النووي، ومترافق إلى حبات مغناطيسية streptavidin المغلفة 4 المسمى البيوتين. حضنت الطعم RNA مع لست] الخلوية للسماح لتشكيل المجمعات الحمض النووي الريبي البروتين، والتي يتم سحبها بعد ذلك إلى أسفل على الوقوف المغناطيسي. وبشكل أكثر تحديدا، وصف بروتوكول المنسدلة RNA دون استخدام أي جزء من الحمض النووي الريبي AR 3'UTR كما الطعم لاسترداد البروتين الحر، والممارسات التجارية التقييدية أعرب عالميا بد أن 3'UTR من من mRNAs 6،7، من theadipocytelysate الثقافة الابتدائية. لاختبار خصوصية ملزمة من هذا الاختبار، وRNAas غير الحكومية ذات الصلة وكذلك حبات streptavidin فارغة يتم تضمين عن السيطرة. هذا البروتوكول هو متوافق مع النشاف الغربية أو قياس الطيف الكتلي (MS) لتأكيد القبض على الممارسات التجارية التقييدية محددة أو لتحديد مرجع الكامل لهذه الممارسات واستولت على التوالي 8.
تتوفر العديد من التقنيات المتاحة لدراسة تفاعل الحمض النووي الريبي البروتينالصورة. للكشف عن الرنا بد من الممارسات التجارية التقييدية معين، RIP (RNA مناعي) وCLIP (يشابك الأشعة فوق البنفسجية ومناعي) يمكن تطبيقها. في المقابل، لتحديد الشركاء البروتين من الحمض النووي الريبي معينة، RNA المنسدلة، غرد (لونين عزل من قبل تنقية RNA)، الرسم البياني (تحليل التهجين القبض على أهداف RNA) وRAP (تنقية العقاقير RNA) يمكن تطبيقها. بالمقارنة مع لاحقة منها، RNA تقنية المنسدلة يأخذ أقل جهد لاقامة. ويمكن أن تستخدم لالتقاط البروتينات في المختبر، وفي الجسم الحي. النهج المتبع في الجسم الحي من الحمض النووي الريبي المنسدلة، التي هي من الناحية الفنية أكثر صعوبة من نظيرتها في المختبر، يحفظ تفاعلات الحمض النووي الريبي البروتين يشابك في الخلايا، يلتقط الرنا الموسومة أبتمر من الاهتمام من الخلايا، وبعد ذلك بالكشف عن الممارسات التجارية التقييدية المربوطة. RNA المنسدلة يمكن استخدامها لإثراء الممارسات التجارية التقييدية وفرة منخفضة، وعزل وتحديد المجمعات الحمض النووي الريبي البروتين التي لها أدوار وظيفية متنوعة في السيطرة على التنظيم الخلوي 9،10 </sتصل>.
Protocol
Representative Results
Discussion
lncRNAs والممارسات التجارية التقييدية أدوارا حيوية في الصحة والمرض، ولكن الآليات الجزيئية لهذه الجزيئات غير مفهومة. تحديد البروتينات التي تتفاعل مع جزيئات lncRNA هو خطوة مهمة نحو توضيح الآليات التنظيمية. ويستند إثراء الممارسات التجارية التقييدية من قبل نظام فحص المنسدل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل سنغافورة جبهة الخلاص الوطني الزمالة (جبهة الخلاص الوطني، 2011NRF-NRFF001-025) وكذلك CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014).
Materials
| Major materials used in this study. | |||
| MEGAscript kit | Ambion | ||
| Biotin-14-CTP | Invitrogen | ||
| NucAway spin columns | Ambion | ||
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | ||
| HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261) | Santa Cruz Biotechnology | ||
| Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005) | Santa Cruz Biotechnology | ||
| Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free) | HyClone | ||
| Phosphate Buffer Saline (1×PBS) | HyClone | ||
| RNase inhibitor | Bioline | ||
| Protease inhibitor | Sigma | ||
| Pfu Turbo DNA polymerase | Agilent Technologies | ||
| TRIsure | Bioline | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Major equipment used in this study. | |||
| Sorvall Legend Micro 21R centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Sorvall Legend X1R centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Bio-Rad T100 thermal cycler | Bio-Rad | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| BOECO rotator Multi Bio RS-24 | BOECO,Germany | ||
| Protein gel electrophoresis and blotting apparatus | Bio-Rad | ||
| DynaMag-2 magnet | Life Technologies |
References
- Huot, M. &. #. 2. 0. 1. ;., et al. The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis. Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).
- Sun, L., et al. Long noncoding RNAs regulate adipogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3387-3392 (2013).
- Engreitz, J. M., et al. The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X-chromosome. Science. 341 (6147), 1237973 (2013).
- Zhao, X. Y., Li, S., Wang, G. X., Yu, Q., Lin, J. D. A long noncoding RNA transcriptional regulatory circuit drives thermogenic adipocyte differentiation. Mol Cell. 55, 372-382 (2014).
- Alvarez-Dominguez, J. R., et al. De novo reconstruction of adipose tissue transcriptomes reveals long non-coding RNA regulators of brown adipocyte development. Cell Metab. 21, 764-776 (2015).
- Adams, D. J., Beveridge, D. J., van der Weyden, L., Mangs, H., Leedman, P. J., Morris, B. J. HADHB, HuR, and CP1 bind to the distal 3-untranslated region of human renin mRNA and differentially modulate renin expression. J Biol Chem. 278 (45), 44894-44903 (2003).
- Yeap, B. B., et al. Novel binding of HuR and poly(C)-binding protein to a conserved UC-rich motif within the 3´ untranslated region of the androgen receptor messenger RNA. J Biol Chem. 277, 27183-27192 (2002).
- König, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives. Nat Rev Genet. 13, 77-83 (2012).
- Ferrè, F., Colantoni, A., Helmer-Citterich, M. Revealing protein-lncRNA interaction. Briefings in Bioinformatics. , 1-11 (2015).
- McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15 (1), 203 (2014).
- Lee, Y. S., et al. AU-rich element-binding protein negatively regulates CCAAT enhancer binding protein mRNA stability during long term synaptic plasticity in Aplysia. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15520-15525 (2012).
- Hermann, M., Cermak, T., Voytas, D. F., Pelczar, P. Mouse genome engineering using designer nucleases. J Vis Exp. (86), (2014).
- Tsai, M. C., et al. Long Noncoding RNA as Modular Scaffold of Histone Modification Complexes. Science. 329 (5992), 689-693 (2010).
- Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505, 706-709 (2014).
- Li, H., et al. Identification of mRNA binding proteins that regulate the stability of LDL receptor mRNA through AU rich elements. J Lipid Res. 50 (5), 820-831 (2009).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
- Chu, C., et al. Systematic Discovery of Xist RNA Binding Proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs. Nat Struct Mol Biol. 22 (1), 29-35 (2015).
- Zhao, J., et al. Genome-wide identification of Polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).
