זיהוי של חלבונים קושרי RNA על ידי<em> במבחנה</em> RNA הנפתח ב adipocyte תרבות
Summary
פרוטוקול RNA הנפתח הוא מותאם כאן לגילוי של אינטראקציות בין חלבונים קושרי RNA (RBPs) ו noncoding וכן RNAs קידוד. מקטע RNA מן לקולטן האנדרוגן (AR) שימש כדוגמה כדי להדגים כיצד לאחזר RBP שלה lystate של adipocytes חום ראשוני.
Abstract
חלבוני קושרי RNA (RBPs) הם מתעוררים כשכבה רגולטורית ההתפתחות והתפקוד של שומן. RBPs לשחק תפקיד מפתח בוויסות ביטוי גנים ברמות posttranscriptional ידי המשפיע על יעילות יציבות translational של mRNAs היעד. טכניקה הנפתח RNA כבר בשימוש נרחב כדי לחקור את האינטראקציה RNA חלבון, אשר יש צורך להבהיר את המנגנון שבבסיס RBPs 'וכן RNAs ללא קידוד ארוך "(lncRNAs) פונקציה. עם זאת, שפע השומנים הגבוה ב adipocytes מציב אתגר טכני בביצוע הניסוי הזה. הנה פרוטוקול נפתח RNA מפורט מותאם לתרבות adipocyte העיקרית. מקטע RNA מן של קולטן האנדרוגן (AR) 3 'באזור מתורגמים (3'UTR) המכיל elementwas adenylate-uridylate עשירי כדוגמא כדי להדגים כיצד לאחזר שותף RBP שלה, חלבון חור, מן lystate adipocyte. השיטה המתוארת כאן יכולה להיות מיושמת כדי לזהות את יחסי הגומלין ביןRBPs ו RNAs noncoding, כמו גם בין RBPs ו RNAs קידוד.
Introduction
RBPs הם חלבונים אשר נקלטות על ידי RNA גדילי כפול או יחיד בתאים ולהשתתף ביצירת קומפלקסים-חלבון RNA. RBPs עלול להיקשר מגוון מיני RNA, כולל ה- mRNA ו RNAs noncoding הארוך (lncRNAs) ובין השאר השפיעו ברמות שלאחר התעתיק. RBPs ו lncRNAs שניהם מתעוררים רגולטורי רומן כפי בפיתוח שומן ולתפקד 1,2,3. כדי להבין את המנגנון של RBP- ורגולציה בתיווך lncRNA של מסלולים הסלולר, זה לעתים קרובות יש צורך לזהות את האינטראקציה בין מולקולת RNA ספציפי אחד או כמה RBPs, ו, לפעמים, לזהות את מלוא הספקטרום של שותפים חלבון של RNA תמליל. עם זאת, הניסוי יכול להיות מאתגר בשל התכולה הגבוהה של שומני adipocytes. פרוטוקול RNA הנפתח המתואר כאן יכול להיות מועסק על מנת לאחזר שותפי החלבון של RNA מסוים מן lysates adipocyte של תרבויות העיקריות 4,5.
הרציונל פרוטו זהcol מסוכמת כדלקמן. פיתיון RNA הוא במבחנה עבדה מתבנית DNA, ביוטין שכותרתו מצומדות כדי חרוזים מגנטיים צופה streptavidin 4. הפיתיון RNA הוא מודגרות עם lysates הסלולר כדי לאפשר היווצרות של מתחמי RNA חלבון, אשר לאחר מכן הם משכו מטה על מעמד מגנטי. באופן ספציפי יותר, פרוטוקול הנפתח RNA המתואר להלן להשתמש שבר RNA מן AR 3'UTR כפיתיון כדי לאחזר חלבון חור, RBP כבול הביע אוניברסלי 3'UTR של תעתיקי 6,7, מ theadipocytelysate של התרבות העיקרי. כדי לבדוק את הספציפיות מחייב של assay זה, שאינו רלוונטי RNAas גם חרוזים streptavidin ריק כלול כמו שליטה. פרוטוקול זה תואם מערבי סופג או ספקטרומטריית מסה (MS) כדי לאשר את לכידתו של RBP ספציפי או לזהות את הרפרטואר המלא של RBPs שנתפס, בהתאמה 8.
טכניקות קיימות מספר לחקור את האינטראקציה RNA חלבוןים. כדי לחשוף RNAs כבול נתון RBP, RIP (immunoprecipitation RNA) CLIP (crosslinking UV ו immunoprecipitation) יכול להיות מיושם. לעומת זאת, לזהות שותפי חלבון של RNA נתון, נפתח RNA, צרצור (בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA), תרשים (ניתוח כלת לכידתו של מטרות RNA) RAP (טיהור antisense RNA) יכול להיות מיושם. לשם השוואה עם אלה מאוחר יותר, טכניקה נפתחת RNA לוקחת פחות מאמצת להקים. זה יכול להיות מועסק על מנת ללכוד חלבונים במבחנה ובחי. הגישה vivo של RNA הנפתח, אשר מבחינה טכנית יותר מאתגר מאשר עמיתו במבחנה שלה, שומרת אינטראקציות חלבון RNA על ידי crosslinking בתאים, לוכדת RNAs מתויג aptamer עניין מתאי, ולאחר מכן מזהה RBPs כבול. RNA הנפתח ניתן להשתמש כדי להעשיר RBPs בשפע נמוך, וכדי לבודד ולזהות את המתחמים-חלבון RNA שיש תפקידים פונקציונליים מגוונים בשליטת רגולציה הסלולר 9,10 </sעד>.
Protocol
Representative Results
Discussion
יש lncRNAs ו RBPs תפקידים חיוניים בבריאות ובחולי, אולם המנגנונים המולקולריים של מולקולות אלה הם הבינו היטב. זיהוי של חלבוני אינטראקציה עם מולקולות lncRNA הוא צעד מפתח לקראת הבהרת מנגנוני הוויסות. העשרת RBPs ידי מערכת assay הנפתח RNA מבוססת על ב-פתרון לכיד של אינטראקציה מורכבת כך חל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי מענק סינגפור NRF (NRF-2011NRF-NRFF001-025) וכן CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014).
Materials
| Major materials used in this study. | |||
| MEGAscript kit | Ambion | ||
| Biotin-14-CTP | Invitrogen | ||
| NucAway spin columns | Ambion | ||
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | ||
| HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261) | Santa Cruz Biotechnology | ||
| Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005) | Santa Cruz Biotechnology | ||
| Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free) | HyClone | ||
| Phosphate Buffer Saline (1×PBS) | HyClone | ||
| RNase inhibitor | Bioline | ||
| Protease inhibitor | Sigma | ||
| Pfu Turbo DNA polymerase | Agilent Technologies | ||
| TRIsure | Bioline | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Major equipment used in this study. | |||
| Sorvall Legend Micro 21R centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Sorvall Legend X1R centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Bio-Rad T100 thermal cycler | Bio-Rad | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| BOECO rotator Multi Bio RS-24 | BOECO,Germany | ||
| Protein gel electrophoresis and blotting apparatus | Bio-Rad | ||
| DynaMag-2 magnet | Life Technologies |
References
- Huot, M. &. #. 2. 0. 1. ;., et al. The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis. Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).
- Sun, L., et al. Long noncoding RNAs regulate adipogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3387-3392 (2013).
- Engreitz, J. M., et al. The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X-chromosome. Science. 341 (6147), 1237973 (2013).
- Zhao, X. Y., Li, S., Wang, G. X., Yu, Q., Lin, J. D. A long noncoding RNA transcriptional regulatory circuit drives thermogenic adipocyte differentiation. Mol Cell. 55, 372-382 (2014).
- Alvarez-Dominguez, J. R., et al. De novo reconstruction of adipose tissue transcriptomes reveals long non-coding RNA regulators of brown adipocyte development. Cell Metab. 21, 764-776 (2015).
- Adams, D. J., Beveridge, D. J., van der Weyden, L., Mangs, H., Leedman, P. J., Morris, B. J. HADHB, HuR, and CP1 bind to the distal 3-untranslated region of human renin mRNA and differentially modulate renin expression. J Biol Chem. 278 (45), 44894-44903 (2003).
- Yeap, B. B., et al. Novel binding of HuR and poly(C)-binding protein to a conserved UC-rich motif within the 3´ untranslated region of the androgen receptor messenger RNA. J Biol Chem. 277, 27183-27192 (2002).
- König, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives. Nat Rev Genet. 13, 77-83 (2012).
- Ferrè, F., Colantoni, A., Helmer-Citterich, M. Revealing protein-lncRNA interaction. Briefings in Bioinformatics. , 1-11 (2015).
- McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15 (1), 203 (2014).
- Lee, Y. S., et al. AU-rich element-binding protein negatively regulates CCAAT enhancer binding protein mRNA stability during long term synaptic plasticity in Aplysia. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15520-15525 (2012).
- Hermann, M., Cermak, T., Voytas, D. F., Pelczar, P. Mouse genome engineering using designer nucleases. J Vis Exp. (86), (2014).
- Tsai, M. C., et al. Long Noncoding RNA as Modular Scaffold of Histone Modification Complexes. Science. 329 (5992), 689-693 (2010).
- Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505, 706-709 (2014).
- Li, H., et al. Identification of mRNA binding proteins that regulate the stability of LDL receptor mRNA through AU rich elements. J Lipid Res. 50 (5), 820-831 (2009).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
- Chu, C., et al. Systematic Discovery of Xist RNA Binding Proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs. Nat Struct Mol Biol. 22 (1), 29-35 (2015).
- Zhao, J., et al. Genome-wide identification of Polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).
