פרוטוקול RNA הנפתח הוא מותאם כאן לגילוי של אינטראקציות בין חלבונים קושרי RNA (RBPs) ו noncoding וכן RNAs קידוד. מקטע RNA מן לקולטן האנדרוגן (AR) שימש כדוגמה כדי להדגים כיצד לאחזר RBP שלה lystate של adipocytes חום ראשוני.
חלבוני קושרי RNA (RBPs) הם מתעוררים כשכבה רגולטורית ההתפתחות והתפקוד של שומן. RBPs לשחק תפקיד מפתח בוויסות ביטוי גנים ברמות posttranscriptional ידי המשפיע על יעילות יציבות translational של mRNAs היעד. טכניקה הנפתח RNA כבר בשימוש נרחב כדי לחקור את האינטראקציה RNA חלבון, אשר יש צורך להבהיר את המנגנון שבבסיס RBPs 'וכן RNAs ללא קידוד ארוך "(lncRNAs) פונקציה. עם זאת, שפע השומנים הגבוה ב adipocytes מציב אתגר טכני בביצוע הניסוי הזה. הנה פרוטוקול נפתח RNA מפורט מותאם לתרבות adipocyte העיקרית. מקטע RNA מן של קולטן האנדרוגן (AR) 3 'באזור מתורגמים (3'UTR) המכיל elementwas adenylate-uridylate עשירי כדוגמא כדי להדגים כיצד לאחזר שותף RBP שלה, חלבון חור, מן lystate adipocyte. השיטה המתוארת כאן יכולה להיות מיושמת כדי לזהות את יחסי הגומלין ביןRBPs ו RNAs noncoding, כמו גם בין RBPs ו RNAs קידוד.
RBPs הם חלבונים אשר נקלטות על ידי RNA גדילי כפול או יחיד בתאים ולהשתתף ביצירת קומפלקסים-חלבון RNA. RBPs עלול להיקשר מגוון מיני RNA, כולל ה- mRNA ו RNAs noncoding הארוך (lncRNAs) ובין השאר השפיעו ברמות שלאחר התעתיק. RBPs ו lncRNAs שניהם מתעוררים רגולטורי רומן כפי בפיתוח שומן ולתפקד 1,2,3. כדי להבין את המנגנון של RBP- ורגולציה בתיווך lncRNA של מסלולים הסלולר, זה לעתים קרובות יש צורך לזהות את האינטראקציה בין מולקולת RNA ספציפי אחד או כמה RBPs, ו, לפעמים, לזהות את מלוא הספקטרום של שותפים חלבון של RNA תמליל. עם זאת, הניסוי יכול להיות מאתגר בשל התכולה הגבוהה של שומני adipocytes. פרוטוקול RNA הנפתח המתואר כאן יכול להיות מועסק על מנת לאחזר שותפי החלבון של RNA מסוים מן lysates adipocyte של תרבויות העיקריות 4,5.
הרציונל פרוטו זהcol מסוכמת כדלקמן. פיתיון RNA הוא במבחנה עבדה מתבנית DNA, ביוטין שכותרתו מצומדות כדי חרוזים מגנטיים צופה streptavidin 4. הפיתיון RNA הוא מודגרות עם lysates הסלולר כדי לאפשר היווצרות של מתחמי RNA חלבון, אשר לאחר מכן הם משכו מטה על מעמד מגנטי. באופן ספציפי יותר, פרוטוקול הנפתח RNA המתואר להלן להשתמש שבר RNA מן AR 3'UTR כפיתיון כדי לאחזר חלבון חור, RBP כבול הביע אוניברסלי 3'UTR של תעתיקי 6,7, מ theadipocytelysate של התרבות העיקרי. כדי לבדוק את הספציפיות מחייב של assay זה, שאינו רלוונטי RNAas גם חרוזים streptavidin ריק כלול כמו שליטה. פרוטוקול זה תואם מערבי סופג או ספקטרומטריית מסה (MS) כדי לאשר את לכידתו של RBP ספציפי או לזהות את הרפרטואר המלא של RBPs שנתפס, בהתאמה 8.
טכניקות קיימות מספר לחקור את האינטראקציה RNA חלבוןים. כדי לחשוף RNAs כבול נתון RBP, RIP (immunoprecipitation RNA) CLIP (crosslinking UV ו immunoprecipitation) יכול להיות מיושם. לעומת זאת, לזהות שותפי חלבון של RNA נתון, נפתח RNA, צרצור (בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA), תרשים (ניתוח כלת לכידתו של מטרות RNA) RAP (טיהור antisense RNA) יכול להיות מיושם. לשם השוואה עם אלה מאוחר יותר, טכניקה נפתחת RNA לוקחת פחות מאמצת להקים. זה יכול להיות מועסק על מנת ללכוד חלבונים במבחנה ובחי. הגישה vivo של RNA הנפתח, אשר מבחינה טכנית יותר מאתגר מאשר עמיתו במבחנה שלה, שומרת אינטראקציות חלבון RNA על ידי crosslinking בתאים, לוכדת RNAs מתויג aptamer עניין מתאי, ולאחר מכן מזהה RBPs כבול. RNA הנפתח ניתן להשתמש כדי להעשיר RBPs בשפע נמוך, וכדי לבודד ולזהות את המתחמים-חלבון RNA שיש תפקידים פונקציונליים מגוונים בשליטת רגולציה הסלולר 9,10 </sעד>.
יש lncRNAs ו RBPs תפקידים חיוניים בבריאות ובחולי, אולם המנגנונים המולקולריים של מולקולות אלה הם הבינו היטב. זיהוי של חלבוני אינטראקציה עם מולקולות lncRNA הוא צעד מפתח לקראת הבהרת מנגנוני הוויסות. העשרת RBPs ידי מערכת assay הנפתח RNA מבוססת על ב-פתרון לכיד של אינטראקציה מורכבת כך חל…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומנה על ידי מענק סינגפור NRF (NRF-2011NRF-NRFF001-025) וכן CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014).
Major materials used in this study. | |||
MEGAscript kit | Ambion | ||
Biotin-14-CTP | Invitrogen | ||
NucAway spin columns | Ambion | ||
Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | ||
HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261) | Santa Cruz Biotechnology | ||
Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005) | Santa Cruz Biotechnology | ||
Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free) | HyClone | ||
Phosphate Buffer Saline (1×PBS) | HyClone | ||
RNase inhibitor | Bioline | ||
Protease inhibitor | Sigma | ||
Pfu Turbo DNA polymerase | Agilent Technologies | ||
TRIsure | Bioline | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Major equipment used in this study. | |||
Sorvall Legend Micro 21R centrifuge | Thermo Scientific | ||
Sorvall Legend X1R centrifuge | Thermo Scientific | ||
Bio-Rad T100 thermal cycler | Bio-Rad | ||
Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ||
BOECO rotator Multi Bio RS-24 | BOECO,Germany | ||
Protein gel electrophoresis and blotting apparatus | Bio-Rad | ||
DynaMag-2 magnet | Life Technologies |