Обнаружение РНК-связывающих белков<em> In Vitro</em> РНК спускающее в адипоцитов культуры
Summary
Выпадающий протокол РНК оптимизирован здесь для обнаружения взаимодействий между РНК-связывающих белков (ОДП) и некодирующих, а также кодирования РНК. Фрагмент РНК из рецептора андрогена (AR) был использован в качестве примера, чтобы продемонстрировать, как извлечь ее из ОПБ lystate первичных бурых адипоцитов.
Abstract
РНК-связывающие белки (ОДП) появляются в качестве регулирующего слоя в развитии и функционировании жировой ткани. ОДП играют ключевую роль в регуляции экспрессии генов на посттранскрипционных уровнях, влияя на стабильность и поступательное эффективность мРНК мишеней. РНК выпадающий метод широко используется для изучения взаимодействия РНК-белок, который необходим, чтобы выяснить механизм, лежащий в основе функции ОДП ", а также длинные некодирующие РНК» (lncRNAs). Однако высокая липидный изобилие в адипоциты представляет собой сложную техническую задачу в проведении этого эксперимента. Здесь подробно выпадающий протокол РНК оптимизирован для первичной культуры адипоцитов. Фрагмент РНК из (AR) 3 'нетранслируемой области рецептора андрогена (в 3'UTR), содержащие аденилатной-uridylate богатых elementwas, используемые в качестве примера, чтобы продемонстрировать, как получить его RBP партнера, Гур белок, из адипоцитов lystate. Описанный здесь способ может быть применен для обнаружения взаимодействий междуОДП и некодирующие РНК, а также между ОДП и кодирование РНК.
Introduction
ОДП представляют собой белки, которые связываются с двойной или одноцепочечной РНК в клетках и участвуют в формировании РНК-белковых комплексов. ОДП может связать различные виды РНК, включая мРНК и длинных некодирующих РНК (lncRNAs), и оказывают свое влияние на пост-транскрипционных уровнях. Оба ОДП и lncRNAs появляются в качестве новых регуляторов в развитии жировой и функции 1,2,3. Для того, чтобы понять механизм RBP- и lncRNA-опосредованной регуляции клеточных путей, часто бывает необходимо, чтобы обнаружить взаимодействие между конкретной молекулы РНК и одного или нескольких ОДП, и, иногда, чтобы определить полный спектр белковых партнеров РНК транскрипт. Тем не менее, этот эксперимент может быть сложной задачей из-за высокого содержания липидов в адипоцитах. Протокол спускающее РНК , описанный здесь может быть использовано для получения белковых партнеров специфической РНК из адипоцитов лизатов первичных культур 4,5.
Обоснование для этого протоCol можно суммировать следующим образом. РНК приманку в пробирке транскрипции из матрицы ДНК, меченного биотином и конъюгированные с покрытыми стрептавидином магнитными гранулами 4. РНК приманку инкубируют с клеточными лизатов, чтобы обеспечить образование РНК-белковых комплексов, которые впоследствии снесенных на магнитной подставке. Более конкретно, РНК протокол спускающее описано ниже использовать фрагмент РНК из AR 3' – UTR в качестве приманки , чтобы получить Hur протеин, универсально выраженный ОПБ , связанный с 3' – UTR мРНК 6,7, от theadipocytelysate первичной культуры. Для проверки специфичности связывания этого анализа, а нерелевантных RNAas также пустые стрептавидином шарики включен в качестве контроля. Этот протокол совместим с вестерн – блоттинга или масс – спектрометрии (MS) , чтобы подтвердить захват конкретного ОПБ или определить полный репертуар захваченных ОДП соответственно 8.
Некоторые методы доступны для изучения взаимодействия РНК-белокs. Для выявления РНК, связанные с данной РСП, RIP (РНК иммунопреципитации) и CLIP (УФ-сшивка и иммунопреципитация) могут быть применены. В противоположность этому, для выявления белковых партнеров данной РНК, РНК выпадающий, Chirp (хроматина изоляция путем очистки РНК), ДИАГРАММА (захват анализ гибридизации РНК-мишеней) и RAP (очистка антисмысловой РНК) могут быть применены. По сравнению с более поздними, РНК выпадающий метод требует меньших усилий, чтобы создать. Он может быть использован для захвата белков в пробирке и в естественных условиях. В естественных условиях подход РНК спуском, который является технически более сложной , чем его аналог в пробирке, сохраняет РНК-белковых взаимодействий путем сшивания в клетках, захватывает аптамеров меченные РНК , представляющие интерес из клеток, а затем обнаруживает связанные ОДП. РНК спускающее может быть использован для обогащения низких обильные ОДП, и для выделения и идентификации РНК-белковых комплексов , которые имеют различные функциональные роли в управлении клеточной регуляции 9,10 </sвверх>.
Protocol
Representative Results
Discussion
lncRNAs и ОДП играют жизненно важную роль в здоровье и болезни, однако молекулярные механизмы этих молекул изучены слабо. Идентификация белков, которые взаимодействуют с молекулами lncRNA является ключевым шагом на пути к выяснению механизмов регулирования. Обогащение ОДП по выпадающим сис…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась Сингапур NRF стипендий (NRF-2011NRF-NRFF001-025), а также CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014).
Materials
| Major materials used in this study. | |||
| MEGAscript kit | Ambion | ||
| Biotin-14-CTP | Invitrogen | ||
| NucAway spin columns | Ambion | ||
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | ||
| HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261) | Santa Cruz Biotechnology | ||
| Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005) | Santa Cruz Biotechnology | ||
| Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free) | HyClone | ||
| Phosphate Buffer Saline (1×PBS) | HyClone | ||
| RNase inhibitor | Bioline | ||
| Protease inhibitor | Sigma | ||
| Pfu Turbo DNA polymerase | Agilent Technologies | ||
| TRIsure | Bioline | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Major equipment used in this study. | |||
| Sorvall Legend Micro 21R centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Sorvall Legend X1R centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Bio-Rad T100 thermal cycler | Bio-Rad | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| BOECO rotator Multi Bio RS-24 | BOECO,Germany | ||
| Protein gel electrophoresis and blotting apparatus | Bio-Rad | ||
| DynaMag-2 magnet | Life Technologies |
References
- Huot, M. &. #. 2. 0. 1. ;., et al. The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis. Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).
- Sun, L., et al. Long noncoding RNAs regulate adipogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3387-3392 (2013).
- Engreitz, J. M., et al. The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X-chromosome. Science. 341 (6147), 1237973 (2013).
- Zhao, X. Y., Li, S., Wang, G. X., Yu, Q., Lin, J. D. A long noncoding RNA transcriptional regulatory circuit drives thermogenic adipocyte differentiation. Mol Cell. 55, 372-382 (2014).
- Alvarez-Dominguez, J. R., et al. De novo reconstruction of adipose tissue transcriptomes reveals long non-coding RNA regulators of brown adipocyte development. Cell Metab. 21, 764-776 (2015).
- Adams, D. J., Beveridge, D. J., van der Weyden, L., Mangs, H., Leedman, P. J., Morris, B. J. HADHB, HuR, and CP1 bind to the distal 3-untranslated region of human renin mRNA and differentially modulate renin expression. J Biol Chem. 278 (45), 44894-44903 (2003).
- Yeap, B. B., et al. Novel binding of HuR and poly(C)-binding protein to a conserved UC-rich motif within the 3´ untranslated region of the androgen receptor messenger RNA. J Biol Chem. 277, 27183-27192 (2002).
- König, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives. Nat Rev Genet. 13, 77-83 (2012).
- Ferrè, F., Colantoni, A., Helmer-Citterich, M. Revealing protein-lncRNA interaction. Briefings in Bioinformatics. , 1-11 (2015).
- McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15 (1), 203 (2014).
- Lee, Y. S., et al. AU-rich element-binding protein negatively regulates CCAAT enhancer binding protein mRNA stability during long term synaptic plasticity in Aplysia. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15520-15525 (2012).
- Hermann, M., Cermak, T., Voytas, D. F., Pelczar, P. Mouse genome engineering using designer nucleases. J Vis Exp. (86), (2014).
- Tsai, M. C., et al. Long Noncoding RNA as Modular Scaffold of Histone Modification Complexes. Science. 329 (5992), 689-693 (2010).
- Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505, 706-709 (2014).
- Li, H., et al. Identification of mRNA binding proteins that regulate the stability of LDL receptor mRNA through AU rich elements. J Lipid Res. 50 (5), 820-831 (2009).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
- Chu, C., et al. Systematic Discovery of Xist RNA Binding Proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs. Nat Struct Mol Biol. 22 (1), 29-35 (2015).
- Zhao, J., et al. Genome-wide identification of Polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).
