RNA结合蛋白的检测通过<em>体外</em在脂肪细胞培养> RNA下拉
Summary
的RNA下拉协议这里优化用于检测RNA结合蛋白（限制性商业惯例）和非编码以及编码RNA之间的相互作用。从雄激素受体（AR）的RNA片段作为例子来演示如何从初级的棕色脂肪细胞的lystate检索其RBP。
Abstract
RNA结合蛋白（限制性商业惯例）正在成为在脂肪的发育和功能的调节层。限制性商业惯例通过影响靶mRNA的稳定性和翻译效率发挥在转录后水平的基因表达的调控中起关键作用。 RNA的下拉技术已被广泛用于研究RNA-蛋白质相互作用，这是必要阐明该机制底层限制性商业惯例'以及长的非编码RNA“（lncRNAs）函数。然而，高血脂丰度在脂肪细胞构成在进行该实验中一个技术挑战。这里详细的RNA下拉协议是初级脂肪细胞培养进行了优化。从雄激素受体的（AR）3'非翻译区含作为一个例子来说明如何检索其RBP合作伙伴的HuR蛋白质，脂肪细胞从一个lystate富含腺苷酸尿苷酸-elementwas（3'UTR）的RNA片段。可以应用这里描述的方法来检测之间的相互作用限制性商业惯例和非编码RNA，以及间限制性商业惯例和编码RNA。
Introduction
限制性商业惯例是结合在细胞中的双链或单链RNA和参与形成RNA-蛋白复合物的蛋白质。限制性商业惯例可以结合多种RNA分子，包括mRNA和长非编码RNA（lncRNAs），并在发挥转录后水平的影响力。限制性商业惯例和lncRNAs在脂肪发展逐渐成为新的监管机构和功能1,2,3。理解RBP-的机制和细胞途径lncRNA介导的调节，它通常需要检测特定RNA分子和一个或多个限制性商业惯例之间的相互作用，并且，有时，以识别RNA的蛋白伴侣的全谱成绩单。然而，该实验可以是具有挑战性由于脂质的脂肪细胞的高含量。这里所描述的RNA的下拉协议可被用于检索来自原代培养4,5的脂肪细胞裂解物的特定RNA的蛋白质的合作伙伴。
理这个原山口总结如下。的RNA诱饵是在体外从DNA模板转录，生物素标记和缀合到链霉抗包被的磁珠4。所述RNA诱饵与细胞裂解物孵育以允许RNA-蛋白质复合物，其随后被拉下来的磁性支架的形成。更具体地，该RNA下拉协议如下所述使用的RNA片段从AR 3'UTR作为诱饵检索的HuR蛋白质，普遍表达RBP势必的mRNA 6,7的3'UTR，从theadipocytelysate原代培养。为了测试该测定的结合特异性，非相关RNAas以及空白链霉珠被包括作为对照。此协议是与蛋白质印迹或质谱（MS）兼容，以确认一个特定RBP的捕获或识别捕获的限制性商业惯例，分别为8的全剧目。
几种技术可用于研究RNA-蛋白质相互作用秒。揭示通过一个给定的RBP，RIP（RNA免疫沉淀）和CLIP（UV交联和免疫沉淀）结合的RNA可以应用。与此相反，以确定一个给定RNA的蛋白质伙伴，RNA下拉，啁啾（通过RNA纯化染色质分离），图表（RNA靶捕获杂交分析）和RAP（RNA反义纯化）都可以应用。在与后来者相比，RNA下拉技术花费较少的精力来设置。它可以用来捕获蛋白在体外 和体内 。 RNA的下拉，这在技术上是比其体外对应更具挑战性， 在体内的方法，通过在细胞中的交联保留RNA-蛋白质相互作用，捕获的从细胞中感兴趣的适体-标记的RNA，和随后检测结合的限制性商业惯例。 RNA的下拉可以用于充实低丰度限制性商业惯例，并且分离和鉴定在控制细胞调节9,10具有多样功能作用的RNA-蛋白质复合</s了>。
Protocol
Representative Results
Discussion
lncRNAs和限制性商业惯例在健康和疾病的重要角色，但这些分子的分子机制知之甚少。与lncRNA分子相互作用的蛋白的鉴定是朝着阐明的调节机制的关键步骤。通过将RNA下拉测定系统限制性商业惯例的富集是基于在溶液中相互作用的复杂，使得从细胞裂解物蛋白可使用结合于链霉抗磁珠的生物素化的RNA诱饵被选择性地提取的捕获。其他一些方法，如啁啾，图表，RAP可以达到同样的目的，但这些方法?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由新加坡NRF奖学金（NRF-2011NRF-NRFF001-025）以及CBRG（NMRC / CBRG / 0070/2014）的资助。
Materials
| Major materials used in this study. | |||
| MEGAscript kit | Ambion | ||
| Biotin-14-CTP | Invitrogen | ||
| NucAway spin columns | Ambion | ||
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | ||
| HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261) | Santa Cruz Biotechnology | ||
| Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005) | Santa Cruz Biotechnology | ||
| Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free) | HyClone | ||
| Phosphate Buffer Saline (1×PBS) | HyClone | ||
| RNase inhibitor | Bioline | ||
| Protease inhibitor | Sigma | ||
| Pfu Turbo DNA polymerase | Agilent Technologies | ||
| TRIsure | Bioline | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Major equipment used in this study. | |||
| Sorvall Legend Micro 21R centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Sorvall Legend X1R centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Bio-Rad T100 thermal cycler | Bio-Rad | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| BOECO rotator Multi Bio RS-24 | BOECO,Germany | ||
| Protein gel electrophoresis and blotting apparatus | Bio-Rad | ||
| DynaMag-2 magnet | Life Technologies |
References
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